资料来源：周杨，Zulqarnain Baloch，夏雪山. 人类与病毒抗争的持久战: 2020 年度诺贝尔生理学或医学奖解读. 科学通报，2020，65（36）：4182-4187

根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）最新数据，全球约有 7100 万慢性丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染者，2016 年约40万人因该病死亡。我国是世界 HCV 感染者数量最多的国家，约占全球慢性 HCV感染者总量的 14%。值得关注的是，我国仍然有大量患者未被诊断出，并且实际接受规范药物治疗的患者比例较小。

由于 HCV 基因的高度变异性，该病毒容易对抗病毒药物产生耐药突变株，即使泛基因型药物“丙通沙”也已发生了耐药突变，对现有药物的临床应用予以更大的挑战。 HCV变异产生多种基因型和众多亚型，病毒批量培养及生产难度大等不利因素， 致使 HCV 疫苗研发困难重重。 HCV 的防控和临床治疗仍是全人类正在面对的重大健康问题。

当地时间 2020 年10月 5日，在瑞典首都斯德哥尔摩卡罗琳斯卡医学院（Karolinska Institute），诺贝尔奖委员会宣布，2020年诺贝尔生理学或医学奖授予 Harvey J. Alter，Michael Houghton 和 Charles M. Rice，以表彰他们在“发现丙型肝炎病毒”方面作出的突出贡献。本文从病毒多样性及慢性化致病的角度，对发现 HCV 的重大意义做一解读，并探讨未来以 HCV为代表的人类医学病毒研究的重点方向。

1  HCV 是利用分子生物学技术发现病原微生物的成功典范

病毒性肝炎是一种常见的传染性疾病，人类与肝炎病毒的斗争已有两三千年的历史。直至 1965年，美国科学家Baruch Samuel Blumberg 第一次发现人类血液中存在着的澳大利亚抗原，即乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）表面抗原；1970 年，英国科学家 D. S. Dane 在电子显微镜下观察到乙型肝炎病毒颗粒；随后，Feinslone 在1973 年从急性发作期患者的粪便中找到了甲型肝炎病毒（hepatitis A vi-rus，HAV）。至此，根据传播途径，肝炎病毒可被粗略区分为甲型和乙型肝炎病毒。随后，研究人员 1977 年从部分乙肝病毒的病人体内发现了丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV），1983 年发现了经口传播的戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）。由于存在一定比例的因输血导致病毒型肝炎病人，科学家一直致力寻找非甲非乙型肝炎病原体。直到1989 年， Harvey J. Alter 团队[1]利用酵母表达非甲非乙型肝炎病毒部分基因序列获得的 C100-3 蛋白，通过放射免疫分析法可检测到患者体内的抗体。同年，Michael Houghton团队[2]在噬菌体中成功构建了来自非甲非乙肝炎感染患者血清的 cDNA文库，对患者血清采取了大规模的盲筛，并以含有短序列的克隆 5-1-1 作为探针，从文库中筛选获得克隆 81，最终确定 10000 个核苷酸的正链 RNA 来自丙型肝炎病毒（图 1）。

图1  肝炎病毒发现历程

继此重大发现，1995年 Charles M. Rice 团队[3]利用竞争性定量逆转录PCR法，完成了从 3ʹ端末端开始的 HCV全长基因组序列测定，并证实该全长序列具有感染性。2005年，Wakita 团队[4]从急性丙型肝炎患者中获得全长HCV 基因组（JFH），将病毒全长 RNA 转化到 Hun-7 细胞，体外培养可以产生 HCV 病毒颗粒。继而，Harvey J. Alter团队[5]建立了能够高效产生感染性 HCV 病毒的体外细胞培养系统，为研究 HCV 感染致病机制和开展药物疫苗研发建立了技术平台。人类对肝炎病毒的认识过程是 20 世纪人类辉煌抗疫史中浓墨重彩的一笔，HCV 发现的系列成果则是这段世界抗疫科技史的高光时刻。HBV的发现在1976年被授予诺贝尔生理学或医学奖，很大层面依赖了传统的血清学和分离培养等发现与鉴定技术。而 HCV 则是 20 世纪后期分子生物学技术兴起以来，第一个从分离到鉴定主要依赖分子生物学手段发现的病毒。本次诺贝尔奖的授予充分体现了分子生物学技术在病毒发现方面的巨大优势，在新发传染病日益频繁的今天，分子生物学技术在发现未知病原体方面将发挥更重要作用。

2  HCV 是高度变异的黄病毒科典型代表

作为单股正链 RNA 病毒的 HCV，其基因组全长 9.6kb，在感染者体内每天约有10¹²个病毒产生，病毒的半衰期仅 3 h，然而病毒每繁殖一代的基因序列突变率为1.44×10 ⁻³ 核苷酸。如此高的基因突变频率、病毒复制速率及可能出现的重组，推动着 HCV 快速演化。根据同源进化关系，将HCV分为至少6个基因型和超过 100个基因亚型。

众多 HCV 基因型/亚型具有明显的地理分布差异，其中 1型、2 型呈全球流行态势，3 型主要流行于东南亚国家、澳大利亚、南非及北欧，4 型主要发现于埃及、中东及中非地区，5 型主要发现于南部非洲国家，6 型则主要在东南亚国家或来自该地区的移民中发现[6]。HCV 的多样性对疾病进程及药物治疗反应性都有很大影响。研究表明，1 型 HCV病毒的体内复制速率明显高于其他基因型， 1b 型患者肝脏组织学分级、病程进展速度也明显高于 2 型。所感染 HCV基因型的不同是影响治疗反应性的最主要因素，1b 型患者的IFN-α药物治疗效果明显低于 1a、2a、2b 和 3 型，3 型HCV 感染者对“丙通沙”的治疗有效率则低于其他基因型。

HCV 变异产生不同基因型和亚型在临床的诊断、治疗以及预防上具有较大差异，并具有重要临床意义。即使在同一感染者体内，病毒也呈现多样化的趋势，可把基因变异率小于 5%的 HCV 突变株分为众多准种（quasispecies）。特定时间点可检测到的 HCV 准种，是在现时宿主环境下所有变异病毒株被竞争性选择的结果。准种的存在被认为是 HCV 病毒逃逸宿主免疫监控、建立慢性感染的主要原因，并直接影响疾病进程和药物治疗反应性，为衡量病毒感染性、评价病毒免疫逃逸能力、预测疾病进程的重要指标。HCV 的高度遗传变异是多因素共同促进的结果，对临床治疗和预防都造成了严峻的挑战。

作为黄病毒科典型代表，HCV 的发现、鉴定与系统深入的分子病毒学研究是相关领域中具有重大引领意义的标杆和参考系。目前已知其他黄病毒科成员也存在不同分型以及变异，如登革病毒可分为 4 个血清型，每个血清型又分为多个基因型；寨卡病毒可分为非洲型、亚洲型、巴西型 3 个主要流行基因型 [7] 。 多种黄病毒属成员通过特定的传播媒介进行传播，全球广泛流行，致病力强，并有较高的死亡率，且大多没有特效药以及有效的疫苗问世，对人类健康产生巨大威胁。以 HCV 的感染与致病机制研究及药物开发应用经验为借鉴，也将推动其他黄病毒科成员基础研究及防治措施的开发。

3  HCV 是高度慢性化致病的“沉默杀手”

HCV一经感染，仅有 15%~25%的 HCV感染者可通过自身免疫反应清除病毒， 75%~85%的感染者会发展为慢性感染，并有较大比例会发展成肝硬化，每年约 4%~7%的肝硬化患者会进展为肝细胞癌。HCV 能够持久性地与宿主共存，适应感染者机体环境，与宿主达成一种稳定平衡状态，病毒适应宿主环境的生存策略及相关机制一直是 HCV 感染致病的重要研究内容。HCV适应宿主环境的独特策略已经被发现并深入解析，主要体现在 HCV 急性感染期和慢性致病期。

急性感染期间，宿主的先天性和获得性免疫应答分别对HCV复制起到重要的抑制作用。干扰素（interferon，IFN）和干扰素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）编码蛋白作为宿主先天免疫应答的信号蛋白，其表达水平被上调以抑制 HCV 在细胞中的复制，并激活自然杀伤性细胞（NK细胞），使受感染细胞溶解；同时，泛素特异性肽酶 18（ubiquitin specific peptidase 18，USP18）和 ISG15 对干扰素信号的下游信号通路具有负调节作用，削减干扰素抗病毒复制能力且阻碍 NK 细胞激活，以帮助 HCV 以低复制速率在宿主细胞内持久存在[8]。另外，T 细胞群引发 HCV 特异性免疫应答，持续强烈的 HCV 特异性细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）与急性 HCV 病程消退和隐匿相关，反之则与 HCV 持久存在相关 [9]。干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNFα）介导非溶细胞性 HCV 清除，产生抗病毒微环境，对 HCV 产生抑制但不杀死受感染细胞，也是 HCV 能够长期存在于宿主细胞的重要原因[10]。

慢性感染期间，由于 HCV 高复制速率和缺乏校对过程的 RdRp 聚合酶使 HCV 基因组遗传呈现高度多样和变异，以帮助其逃逸宿主免疫监控。其次，HCV 蛋白感染内源性IFN 和 Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR），对宿主免疫细胞表现出免疫抑制活性，帮助建立慢性 HCV 感染，且HCV可介导先天免疫细胞的活化和功能，表现出一种独特的免疫规避策略 [11]。研究表明，长期的 HCV 感染使 DC 细胞功能发生障碍，无法诱导 NK 细胞的成熟和 T 细胞的引发[12]；并且 DC 诱导的免疫耐受会使 IL-10 分泌量显著增加，从而抑制 T 细胞增殖，导致无法对 HCV 产生持续的 T细胞免疫应答[13]。另外，持续性的 HCV感染使 T细胞功能障碍，加上调节性 T 细胞（Tregs）分泌免疫抑制细胞因子，使 HCV 特异性 T 细胞无法启动免疫应答[14]，从而建立长期 HCV 慢性化进程。 在持续的低度免疫介导的炎症环境下，肝细胞逐渐凋亡并导致肝纤维化，进一步发展为肝硬化和肝细胞癌。

HCV 利用不同策略与宿主达成一种稳定平衡状态，该状态的隐匿是造成 HCV 成为高度慢性化“杀手”的重要因素。本次诺贝尔生理学或医学奖的获得也揭示了 HCV是病毒适应宿主内环境的过程以及从炎症发展为癌症慢性化进程的重要代表，为研究病原体慢性致病机制提供了宝贵范例。

4  直接抗病毒药物（direct-actingantiviral agents，DAA）研究的成功范例

自 HCV 发现以来的30多年时间内，多种抗 HCV 药物成功研发并用于HCV患者的临床治疗，持续性病毒应答（sustained virological response，SVR）是评价抗 HCV 药物疗效的关键指标。经过数次发展改良后，聚乙二醇化干扰素-α（PEG-IFNα）和利巴韦林联合用药，作为HCV早期治疗方案在临床上得到了广泛使用（图2）。该疗法疗效从20%到80%不等，但长期的治疗中发现该疗法对HCV基因型1的患者疗效差[15]，表明感染基因型的不同对治疗效果具有差异[16]。

图2  HCV 治疗药物的发展历程

随着分子生物学技术的发展，人类对 HCV 蛋白质结构的认知不断加深以及抗反转录病毒药物积累的研发经验，促进了抗 HCV 病毒（DAA）靶向药物的研发。以NS3/4A蛋白酶、NS5B聚合酶以及NS5A聚合酶为靶点，开发出了多个 DAA 药物，如特拉普韦、洛米布韦、达克拉他等[17]。最近，“丙通沙”被世界卫生组织列为 HCV 治疗的首选药物，该药物对所有 HCV 基因型均具有较高的临床治疗效果，也是目前最重要的泛基因治疗药物之一。

由于 HCV 高度的遗传变异性，药物靶点基因变异株能够逃脱药物作用，导致DAA 药物临床治疗耐药性的发生[18，19]。临床观察结果显示，“丙通沙”对3 型 HCV 的疗效较其他基因型 HCV 依然差，在 HIV 与 HCV 合并感染情况下使用“丙通沙”治疗也会产生 NS5A 和 NS5B 基因耐药突变[20]。虽然泛基因药物对抗HCV感染具有明显成效，但长期临床使用的疗效维持值得关注，在经过数年临床使用后，HCV 是否会发生耐药突变以及耐药株的人群传播需要高度重视。

HCV 病毒的高度多样性也使得疫苗研发难度加大，截至目前还没有 HCV 疫苗问世。 黄病毒科成员广泛， 临床药物主要针对的靶点依然以病毒复制酶为主，针对细胞功能开发的宿主定向抗病毒疗法（host-directed therapy，HDT）已经作为抗泛黄病毒药物进入临床使用。然而，由于靶向药物开发周期长，该类药物只有少数通过了临床评估，加上黄病毒特有的高度遗传变异性，泛黄病毒靶向药物的开发依然难度很大，以 HCV 为代表的药物和疫苗的研发是一个长期、充满挑战的过程。本次诺贝尔生理学或医学奖的获得也彰显了以 HCV 为范例，针对高度变异病毒进行药物创新与疫苗研究的重大意义。

5  结语及展望

作为人类有史以来运用分子生物学技术第一次发现的病毒，HCV 的发现是当代医学病毒学发展的重大里程碑。其重大意义首先是为运用分子生物学技术发现未知病毒提供重要参考。而且，HCV 易于在被感染者体内建立慢性感染，与机体免疫系统长期对峙，最终导致肝硬化和肝细胞癌，对其病原学特征的确定及其对机体环境的适应机制的阐明，以及研究炎症到癌症的慢性化致病机制具有代表性意义。此外，HCV 作为黄病毒科重要代表具有高度变异性，给药物和疫苗研发以严峻挑战；HCV 各类靶向抗病毒药物的研发成功与临床应用，为登革热病毒、寨卡病毒等其他黄病毒科成员病毒药物研究提供了成功范例。

从更长远和宽广的视角来看，HCV的发现被授予本次诺贝尔生理学或医学奖，再一次彰显了医学分子生物类自然科学的探索与突破对人类进步与健康发展所具有的重要推动作用。自第一次工业革命来，伴随着人类文明的大发展以及全球化进程的加速，人类在享受科技发展成果的同时，也重视病原微生物对社会健康威胁的重视，更明确了新兴传染病药物和疫苗研发，以及病毒致病机理的认知等方面还存在巨大挑战。人类对未知的探索欲望是一个前进不止的过程，当代分子生物学技术的蓬勃发展和广泛应用，极大地提高了我们对病原体的分离鉴定和药物及疫苗研发能力。HCV 的发现与研究成果充分说明，人类对病原微生物的预防和控制乃至全球危机的处置与全人类健康的保护能力，是以科学探索与技术进步为基础，也是人类生生不息、进一步长期健康发展进步的根本保障。正如诺贝尔奖弘扬科学精神的宗旨所示，在挑战与机遇共存的今天，抓住隐藏的科学机遇， 通过不断摸索和创新，重重挑战终将迎刃而解。

致谢  感谢国家重点研发计划（2017YFC1309302）和云南省重大科技计划（2019ZF004）资助。 感谢重庆市科学技术研究院张华堂研究员的指导与帮助。

参考文献（略）