层析柱分离的一般是本身有颜色或在紫外灯下有荧光的物质。必须先做薄层色谱（TLC）分离试验，以寻找柱色谱的最佳分离条件。

1.薄层色谱操作方法：

所需的东西主要有溶剂、展开剂、玻璃点样毛细管（内径0.3mm）、硅胶铝箔板、染缸。

将被分离的试样用溶剂溶解后，用玻璃点样毛细管（内径0.3mm）蘸取少量溶液，在距薄层板底端约10mm处点样，斑点直径不要过大，约2mm即可，待样点干后放入盛有少量展开剂的染缸中展开。试样中各组分在薄层板上上升的高度依赖于组分在展开剂中的溶解能力和被吸附剂吸附的程度，选取合适的展开剂就可将代表各组分的样点分离开。注意：样点要在染缸中展开剂的液面以上。

化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升的高度的比值称为该化合物的比移值 Rf（0≤Rf≤1）。（计算上升高度的起始位置是样点的原始位置）同等条件，极性小的组分Rf大（即上升的距离大），极性大的组分Rf值小（即上升的距离小）。Rf等于物质移动的距离除以溶剂移动的距离。两物质的△Rf应大于0.2，过柱才能有效分离两物质。

单一溶剂极性和展开能力递增顺序：

石油醚<正己烷<环己烷<四氯化碳<苯<甲苯<氯仿<二氯甲烷<乙醚<乙酸乙酯<吡啶<异丙醇<丙酮<乙醇<甲醇<水<乙腈。

多元展开剂应互溶，且被分离物也最好能溶解于其中。由实验确定所需用的展开剂的方法为：选用一个极性强的溶剂和一个极性弱的溶剂并按不同比例调配，即在非极性溶剂中加入少量极性溶剂，极性由弱到强，比例由小到大，以得到合适的比例。一般最常用的是乙酸乙酯（极性较高）和石油醚（非极性）。先用乙酸乙酯作为展开剂点板，若样点随展开剂整体移动位移较大，用如上的方法，在石油醚中逐渐加大乙酸乙酯的比例，可找到合适的比例将样点分开；若样点能明显的分开，用乙酸乙酯即可；如若样点在原地不动或动的很少，则需加大展开剂的极性，选用乙醇作展开剂，再和石油醚配比，以求能分开，如用乙醇样点仍原地不动或动的很少，则需再加大展开剂的极性，直至样点能分开。（若待分离的试样极性特别高可选用乙腈+水+少量磷酸二氢钾）。理论上可以通过调节石油醚和乙酸乙酯的比例，获得可以取代极性在石油醚和乙酸乙酯之间的各种溶剂，但考虑到试样的溶解性，有时也需要用到甲苯、氯仿、二氯甲烷等溶剂。

2.柱色谱操作方法：

所需的东西主要有溶剂、洗脱剂（即薄层色谱用的展开剂）、柱层析硅胶（200-300目）、层析柱、若干三角瓶。

柱层析分离时，极性小的组分先被淋洗出来，极性大的后出来。

我们用的薄层板是硅胶铝箔板，所以要选的吸附剂是柱层析硅胶，一般选用200-300目的，目数越大分离效果越好，但是分离速度越小；洗脱剂即为薄层色谱选好的展开剂。

装柱：用湿法装柱，吸附剂必须均匀的填在柱内，没有气泡和裂缝。将层析柱在铁架台上调节高度竖直固定好，接洗脱液的三角瓶要能方便的换取。关闭柱下端的活塞，加入纯洗脱剂到柱的四分之一高度，在烧杯中将洗脱剂和吸附剂配制成糊状，粘度要偏小一些，不要太稠。打开活塞，将糊状物倒入柱中，倒一部分就用橡胶管拍打柱身，让吸附剂填料均匀，再倒再拍打。柱装好后，关闭活塞，上塞橡胶塞，让其自然沉降，沉降后吸附剂的高度为柱高度的1/2-2/3，再加0.3mm厚的石英砂层。自然沉降过程一般需几小时。

刚开始灌柱时，柱子的开关应关上，用双联球略加压，压实下方的硅胶吸附剂，这样柱下方的石英砂块周边不易漏下硅胶。

加试样的溶液：用尽量少的溶剂将试样溶解好（分离试样的量与层析柱的直径和长度有关，还与试样的溶解性有关。）。在柱下方用三角瓶接洗脱剂，旋开活塞，待洗脱剂液面与石英砂层上表面相平时，用滴管缓慢的将溶液顺着柱壁加入柱中，千万不能加得过快，以免将硅胶溅起或冲起。溶液加完后，等溶液液面与石英砂层上表面相平时，加2-3滴管的溶剂将柱壁上的试样洗下去，再等溶液液面与石英砂层上表面相平后，再加2-3滴管溶剂，反复几次，直至石英砂层上面的溶液变为无色或浅色。再小心的加入大量的洗脱剂，并不时的补加，不能让洗脱剂的水平面低于石英砂层的上端。

展开和分离：随时关注层析柱中各组分带的位置变化。如分离的是有颜色的试样，注意各色带的位置，经点板检验分别收集在三角瓶中即可。如是有荧光性的物质，则需经常点板后照紫外灯，以随时掌握各组分的洗脱情况，再根据点板的结果分别收集各组分。收集完所需要的组分后，用双联球加压，让残留在柱中的溶剂和洗脱剂完全流出后，再将柱子里的硅胶弄出来用塑料袋装着扔掉。层析柱先用自来水冲洗，再用试样的溶剂清洗，并用双联球加压，将石英砂板上可能残留的试样洗干净，最后用蒸馏水润洗后干燥即可。

有时一种洗脱剂不能将试样分离完全，就需要在分离的过程中换洗脱剂。一般洗脱剂应是试样的溶剂，但有时逼不得已，洗脱剂不是试样的良溶剂时，也可以分离，不过要在加溶液之前和之后加少量溶剂，作一个缓冲带以利于各组分的展开和分离。

最后将收集的各组分旋转蒸发干燥后就可得分离的产物了。

柱长和柱直径一般为：10/1到20/1。

l         待分离物质的溶液高度为柱中硅胶吸附剂的体积的1/10到1/30。

l         两物质的Rf应大于0.2，过柱才能有效分离两物质。

l         过柱时，样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%