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DNA Repair (II) 精选

已有 4547 次阅读 2016-5-4 16:40 |系统分类:科研笔记

Base Excision Repair (II)

DNA真的希望自己突变吗?Well, that depends…

本身仅仅是一个分子而已,何来希望呢?在愚人节那天有篇帖子描述了“水”是如何主宰世界的,其实DNA也有类似的作用。为何在细胞的环境中DNA可以吸引那么多的蛋白有序过来完成她自身的复制?突变,有利有弊:正常情况下DNA是希望安然的生活,异常状况发生后也不得不改变自己(与其说自愿,不如说被迫)。简单来说,DNA的损伤主要来自内源和外源因素,比如自身氧自由基的氧化、复制时引入的错误,再如高能量刺激、致癌因素、病毒感染等情况。引发的损伤也包括多种情况,如碱基的氧化、羟化和水解,核苷酸的错配等,我想Chemists会很好的阐述DNA有哪些变化的可能,根本还是化学键的变化。下面再简单看看BER过程中的酶有哪些关键的作用(主要参考Rachel J. Carter andJason L. Parsons, Mol. Cell. Biol. May 201636:1426-1437)。

PTMs(Posttranslational modification)

转录后修饰之所以越来越活跃,也是得益于基础研究对该领域多年的坚持。大概五年前在实验室接触磷酸化(phosphorylation)、乙酰化(acetylation)、甲基化(methylation)、泛素化(ubiquitylation)和SUMO化(SUMOylation),当时并没有仔细思考每一种修饰背后的故事,只是略微知道这些“化”有着某种调控机制,因为我们专注于病毒的转录调控和细胞的信号通路。现在看来,这些基本存在的调节有着广泛的作用,比如影响蛋白的功能、改变酶的活性、细胞定位、蛋白间的相互作用、表达水平等,其实这只是表观遗传学中的小部分,是PTMs中常见的方式,如今人们发现这些修士可以作为医药研发中的特异靶点,因为看似普遍的机制后面有着特异的效果。近年来发现BER中的关键酶就是受这些PMTs的调节,发挥DNA修复的功能(修饰能影响功能,这与战国时期的“术”的概念好像,与如今的心理作用好像,与为人处世也很像,所要改变的是方式)。

DNA glycosylases

UNG(uracil DNA glycosylase),尿嘧啶DNA糖苷酶,主要与尿嘧啶及其衍生物的的修复有关。UNG1主要分布在线粒体,UNG2主要在细胞核中。UNG2在细胞周期的S期中常被Cdk(cyclin-dependent kinase)磷酸化,不同位置的磷酸化会影响其功能(追求精确氨基酸位置的朋友可阅读原文),其中的两个位置(T6和T126)被磷酸化以后会提升UNG2在体外的DNA glycosylase活性,而p53诱导的PPM1D/Wip1去除T6的磷酸后可降低此活性。此外,在HepG2细胞中有人发现UNG2可被SUMO化,减缓其泛素化后引发的蛋白降解(只是目前人们对泛素化调节UNG2降解的过程并非清楚)。

SMUG1(Single-strand-selective monofunctional uracil glycosylase 1),还是缩写的名字好记,正如其名,这个酶也可以修复尿嘧啶相关的DNA损伤,尤其是U-G错配,主要是在非复制的DNA区域,C中的氨基被脱掉。人们在体内发现SMUG1可通过Cul1或Cul4泛素连接酶介导的泛素化通路降解。HIV中的Vpr可以通过Cul4A-DDB1降解UNG2和SMUG1。

TDG(Thymine DNA glycosylase)可被CBP/P300乙酰化(还记得CR师兄的工作就是围绕这种修饰),之后抑制对APE1的招募,进而抑制了DNA修复的过程,有趣的是在乙酰化位点旁边会发生磷酸化,可能会补偿DNA修复的效应(这个就和我当年的一部分工作很相关了,我一直在寻找D变成N为何会明显提升反式转录激活蛋白的活性,或许真的和糖基化、乙酰化和磷酸化有关,只是没有选好实验方法)。人们TDG最清楚的应算SUMO化,在K330的位置被SUMO1修饰。在体外SUMO-1会降低TDG和DNA间的结合作用,使之从AP位点解离。K341影响蛋白与CBP的作用,一直乙酰化,可能减弱与APE1的相互作用。近期也有研究显示她和泛素系统有关联,只是泛素化位点还不确定。

还有其他的酶如MBD4(methyl CpG binding domain protein 4)在体内、外可被PKC(protein kinase C)磷酸化后提高对甲基化的CpG寡聚核苷酸的切割活性,也就显示在激素诱导的DNA去甲基化和转录抑制中由MBD4介导的BER会发挥一定的作用;MYH(MutY glycosylase homologue)可以切除A-G或A-8oxoG配对中的Adenine,通过磷酸化调节酶的活性;OGG1(8-oxoG DNA glycosylase)是主要修复8-oxoG和FapyG类的DNA损伤的酶,是p300的底物,也有人研究他的泛素化和磷酸化;MPG(Methylpurine DNA glycosylase)主要修复羟基化的碱基,在体外受P300调节,体内的磷酸化也对其活性有影响;还有NTH1(Endonuclease III homologue)主要修复被氧化的嘧啶,EIL1 to -3(The three glycosylasesendonuclease VIII-like protein 1 to -3),未见与PMTs有关的报道。

End Processors

PARP-1,poly(ADP-ribose) polymerase 1,是一个很眼熟的名字,Yahoo一下发现这也是一个热门的靶点,AstraZeneca去年年底的一个商品Lynparza(Olaparib)完成了PhII临床试验,用于治疗经标准疗法治疗但无效的晚期前列腺癌男性患者,百济神州和Merck联手也在开发PARP抑制剂,也有文章报道PARP抑制剂有望用于治疗白血病,还有人用PARP抑制剂于PD-1抗体Keytruda联用,效果明显(美中药源报道“PD-1抑制剂Keytruda对错配修复缺陷的人群应答率好)。PARP抑制剂可以抑制BER和SSB(strand break repair)的修复,尤其是对BRCA1缺陷的乳腺癌细胞有明显的抑制作用,这也是吸引人们关注PARP调节的重要原因。PARP受多种PTMs的调节,体内外受P300的乙酰化、ERK1/2的磷酸化的调节,SUMO化和泛素化对其功能也有影响,其中泛素化的报道相对多一些,人们发现多种E3连接酶会介导PARP的泛素化,比如RNF4、Iduna/RNF146、CHFR等蛋白。

APE1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1)是E.C.Friedberg在1966-1968年间从事博士后研究时“unwittingly”发现的,当时他主要关注的是影响DNA的遗传重组的内切酶,并非修复DNA的内切酶。当时他的导师David Goldthwait(Western Reserve university)希望他通过烷基化改变DNA的构象(作者自称当时too naïve,和导师争论这种方法不可行),在寻找一种内切酶能够攻击此处,诱发重组。结果作者尝试了许多办法,利用同位素标记的DNA被分离后并没有发生重组的现象,不过偶然发现了一种酶确实可以切除烷基化的DNA(首次发现,这种酶被命名为endonuclease II,因为人们从E. coli中发现了endonuclease I)。后来的实验证明这个酶可以特异的识别烷基化的碱基并将其切除,也就是第一个AP E1。现在人们发现乙酰化、磷酸化、泛素化多种PMTs,并且发现了相应的修饰位点,并且多种修饰间存在crosstalk,这就丰富了研究的内容,就会有许多新发现接连出现,谁让这是分子生物学,一旦提到分子水平,就复杂的多,这时真的需要哲学的思维来理清思路。

还有PNKP(Polynucleotide kinase phosphatase)对DNA的活性分为5’激酶和3’磷酸酶两部分,所以比较适合修复SSB,当然也包括BER。人们发现此酶可被ATM和DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK)磷酸化,尤其是在氧化压力下。磷酸化的水平会抑制该蛋白的泛素化过程;FEN-1(Flap endonuclease-1)在Long-patch BER中比较关键,是DNA结构特异的内切酶。

DNA polymerases

提到DNA聚合酶,首相看到的是聚合DNA的过程,再就是PCR中的Taq Pol,要不是近期需要搭建DNA pol的试验方法,我还是不会关注DNA pol的消息。其实DNA pol的家族也是比较庞大的,不论是原核生物还是真核生物,如今已经发现了多种pol,配合不同,功能各异。想想看,DNA聚合需要的基本功能包括聚合酶和外切酶的活性,因为核苷酸沿着模板从因为开始延伸,遇到障碍必然要切除,这可以让DNA完成聚合,当然也有潜能完成修复,只是切除和聚合颠倒顺序的问题。Pol β是作用在BER中主要的DNA pol,受多种PTMs的调节,他的活性高低所引发的就是BER的swift,之后发挥作用的就是Polδ/ε。最后连接骨架的工作交给了DNA ligases(如Lig IIIα和Lig I),同样是倍受PTMs影响的的过程


看到PTMs的广泛调控,我很想知道该如何系统的研究这一调控?发现一个底物,有没有一种直接的分析、模拟可以先预测一下PTM的影响?虽说诸多中修饰对蛋白的功能有影响,如何发现一种关键的调节点,能够用于药物的研发?目前人们从BIG DATA中发现一些未曾被人们仔细研究的信息,蛋白质组学的数据显示有更多的PTMs发生在BER的调节酶上,只是需要更多的实验和时间去揭示其中的机制。深入研究Crosstalk也是很好的方向,绘制出更清晰的网络结构,这样能综合分析PTM对底物的影响。综述文章在最后提到一点在线粒体中一样存在BER现象,有专门的先关蛋白,也是很有趣的地方。

有错误,及时纠正,才不至于酿成无法弥补的后果。DNA的修复机制有很多,可是也抵不过时间的摧残,细胞老化的时候还是一样会发生各种各样的损伤、错误,或许是DNA造就了细胞中的许多酶,也可能是这些酶维持了DNA的稳定性。看着分子间的相互作用,有时真的觉得那就是人类的微型小社会,让人汗颜。

Time for English club…

TJ Pharmaron

2016年5月4日星期三




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