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Sutter P-97 micropipette puller 笔记

已有 10448 次阅读 2011-4-27 09:34 |系统分类:科研笔记

    最近要开始做膜片钳了,实验室以前没有这方面的基础,我是派来摸索的第一人。上个月花了不少精力总算是把仪器基本上搭好了。现在开始练习拉玻璃电极——把实验室十几年前买的一台P-97搬了出来,挨个调参数,总算摸清楚了一些规律。
1. 奇怪的错误信息
因为是外行,一开始就犯了一个低级错误,导致仪器根本不工作,还蹦出一个奇怪的错误信息。试了几次才发现,原来是两边的拉杆过于松弛,并没有向两侧的张力所致。调整了以后就好了。
 
2. RAMP test时用的玻璃管应丢弃不用,否则加热时间会明显缩短,拉出来的电极也不稳定。也许RAMP test以后等待一段时间效果会好一些。我没有试过,也没必要试了——换新的最省事。
 
3. filament box要细细调整,调整后要重新ramp test。如果实验中玻璃管不小心碰到加热丝,必须要重新Ramp。
 
4. 各个参数的含义:
Line: Loop序号。目前我都是采用同样参数的多次重复。
Heat: RAMP-5 至 RAMP+10之间。一般设置成RAMP值即可。数值越高拉成的毛细管坡度越长,电阻值越大。但影响比较有限。
Pull: 向外拉的机械力强度。这个数越大,越容易拉开。拉成的毛细管越细,越长。极可能呈丝状。拉patch clamp玻璃电极时一般设置为0。在需要细长针尖时(比如细胞穿刺)可以调整这个参数。
Velocity: 15-50之间。这个数越大,拉出的毛细管顶端越细,电阻越大。这是影响最大的一个参数,也影响着最终的loop数。
Time: 吹冷却气的时间,单位是毫秒。最大值好像是250。这个参数对毛细管的坡度影响很大。数值越大坡度越大,电极越短,电阻越小。数值从250调整到50可能导致最终的电阻从几兆欧升高到几吉欧。
Pressure: 冷却气压力,单位为psi。压力越大,冷却效果越好。对电极的影响类似于延长吹气时间,使得电极偏短,电阻变小。
如果要拉制1-2um端径,1-5兆欧阻抗的whole cell patch clamp pipette来说,先选定Pull值为0,Time为250,Pressure默认为500,然后取毛细管做Ramp,将Heat设定为RAMP值。此后基本上只需要调整Velocity就可以了。Velocity越小,Loop越多,拉出来的管较短较粗,电阻较低。
顺便说一下,我用的是B150-86-10的毛细管,FB255B的加热丝(Box)。实践表明P-97的稳定性是相当不错的。提供的manual也很详尽。但是还是自己摸索一遍才有更好的认识。
 
5. 电极拉开后等几秒钟,等屏幕显示恢复到初始状态后再开盖,取管,会比较好一点。
 
6. 不同的电极内液,电极外液对电阻的测定结果会有影响。调试时应采用相同的溶液组成。
 
7. Sutter毛细管编号含义。
一个典型的sutter毛细管的编号如下:
2BF150-86-10 第一个2表示有2个平行channel; B -->硼酸盐玻璃;F -->毛细管内有细丝;150-->外径0.15mm;86-->内径0.86mm;10-->长度10cm。我目前用的是B150-86-10.
毛细管内径不能太小,否则灌注电极内液会是一个问题,也影响电极电阻。通常的微量注射器针头外径有两种尺寸,22gauge ~ 0.64mm 或 25gauge ~ 0.45mm。后一种比较少见,但也能买到。
 
附表:摘自sutter p-97 manual, page 73:

HEAT:

= Ramp - 5 to Ramp + 15 for most applications!

PULL:

= 0 Patch, 3-5mm taper and 1-3μm tips

 

= 30 -70 Microinjection, 6-8mm tapers, 0.9 to 0.5μm tips

 

= 70 - 150 High MΩ, 9-15mm tapers, 0.5 to 0.06μm tips

VELOCITY:

= 20 - 60 Patch, 3-5mm taper and 1-3μm tips

 

= 50 - 80 Microinjection, 6-8mm tapers, 0.9 to 0.5μm tips

 

= 70 - 100 High MΩ, 9-15mm tapers, 0.5 to 0.06μm tips

TIME:

= 150 trough, 250 box Patch, 3-5mm taper and 1-3μm tips

 

= 150 trough, 250 box Microinjection, 6-8mm tapers, 0.9 to 0.5μm tips

 

= 150 trough, 250 box High MΩ, 9-15mm tapers, 0.5 to 0.06μm tips

DELAY:

= 1 Patch, 3-5mm taper and 1-3μm tips

 

= 60 - 110 Microinjection, 6-8mm tapers, 0.9 to 0.5μm tips

 

= 40 - 90 High MΩ, 9-15mm tapers, 0.5 to 0.06μm tips

PRESSURE:

= 200 - 500 Thin Walled Glass

 

= 200 - 700 Thick Walled Glass

----------------------------------------------------------------

PARAMETER

INCREASE

DECREASE

Heat

Longer Taper

Shorter Taper

 

Higher Resistance

Lower Resistance

Pull

Smaller Tips

Larger Tips

 

Longer Taper

Shorter Taper

Velocity

Smaller Tips

Larger Tips

Time

Shorter Taper

Longer Taper

(cooling time-ms)

 

 

Pressure

Shorter Taper

Longer Taper

(air flow-psi)

Lower Resistance

Higher Resistance



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