两种培养平台生产重组杆状病毒和狂犬病毒样颗粒的性能比较

摘要

这项工作的目的是在Schott烧瓶中进行上游优化后，评估从该培养平台到搅拌罐式生物反应器的可扩展性，以产生携带G (BVG)和M (BVM)蛋白基因的狂犬病重组杆状病毒，并使用Sf9昆虫细胞作为宿主，从中获得狂犬病病毒样颗粒(VLP)。在Schott烧瓶和生物反应器中进行等同的分析以比较两个系统，并且还进行多变量统计方法以最大化VLP产量，作为BVG和BVM的感染复数(MOI)和收获时间(HT)的函数。在整个测定过程中，监测活细胞密度、细胞活力、病毒滴度、通过斑点印迹的BVG和BVM定量，以及通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的BVG定量。此外，透射电子显微镜用于表征狂犬病VLP。最大VLP表达的最佳组合是BVG和BVM MOI分别为2.3 pfu/细胞和5.1 pfu/细胞，收获时间为108小时。目前的研究证实，在本文所应用的条件下，使用Schott烧瓶和台式生物反应器在对应于Sf9细胞中重组杆状病毒感染过程的细胞死亡动力学方面是等效的。根据研究结果，两个系统中的流体动力学和化学差异似乎极大地影响了病毒和VLP在释放后的完整性。

关键词:

狂犬病病毒样颗粒; 重组杆状病毒; Sf9细胞; 搅拌罐生物反应器; 病毒性感染; 质量源于设计 

介绍

狂犬病是已知最古老的动物传染病之一。它是由一种负链RNA病毒引发的狂犬病病毒属。狂犬病基因组由大约12 kb组成，编码五种结构蛋白:核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA聚合酶(L) 。这种疾病仍然被认为是一个公共卫生问题，特别是在低收入和中等收入国家，每年在全球范围内导致约59，000人死亡(95 %在亚洲和非洲)，造成86亿美元的经济损失。如果不采取预防措施，其死亡率接近100%。安全有效的疫苗可用于预防前和预防后。

人用狂犬病疫苗是由几种培养系统和种子病毒制成的，所有疫苗都需要达到每份肌肉注射剂量2.5 IU的效力。通常使用的培养系统是神经组织、禽类胚胎和细胞培养。病毒在系统中繁殖后，主要用苯酚、β-丙内酯和福尔马林灭活病毒。尽管现代细胞培养疫苗已经提高了人狂犬病疫苗的安全性和有效性，但是它们仍然很昂贵(由于它们在农村诊所很难获得，需要多次给药和冷藏等。)。此外，仍然生产出少数具有不良反应的神经组织疫苗。为了克服这些障碍，新一代狂犬病疫苗正在研发中。这些新平台包括含佐剂的人用狂犬病疫苗、纳米颗粒疫苗技术、具有E1缺失或表达狂犬病G蛋白的黑猩猩来源的腺病毒载体，以及病毒样颗粒(VLP) 。

VLP是一种基于结构病毒蛋白的亚单位疫苗，这些结构病毒蛋白组装成颗粒。VLP的主要优点是它们与天然病毒的形态相似，高度重复的免疫原性表面结构，以及与其亲代病毒相关的细胞摄取和免疫加工途径的保守性。此外，VLPs的非致病性显著提高了它们的安全性。目前已有一系列针对乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒和人乳头瘤病毒的VLP疫苗上市，另一大类疫苗正在研究中。已经使用了几种VLP生产平台，例如细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物。具体而言，杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BVES)是最广泛用于生产VLP的系统之一。BVES的主要宿主是来源于的昆虫细胞系草地夜蛾和尼毛夜蛾，它们在28℃左右生长，不需要一氧化碳。这些特性使得蛋白质生产的规模化成为可能。然而，BVES的主要限制是其分泌蛋白和膜结合蛋白的低产量以及VLP与许多杂质的分离。

上述昆虫细胞系在pH方面的耐受性也延伸到溶解氧张力。在以前的研究中，这些特征允许在非良好控制的培养系统中证明类似的结果，例如由Schott烧瓶和wave生物反应器提供的那些，关于重组组成型昆虫细胞系中的异源蛋白表达。然而，其他科学通讯报道了不同的性能，特别是在搅拌罐生物反应器中。然而，为了在昆虫细胞系中以低成本优化表达系统条件，Schott烧瓶系统被反复使用。迄今为止，关于使用Schott烧瓶优化重组杆状病毒和VLP的上游工艺的报道很少。与分批操作模式中的该过程相关的关键参数仍有待确定，包括感染复数(MOI)、感染时间(TOI)和收获时间(HT) 。

另一方面，质量源于设计(QbD)的概念已经应用于生物制药行业。QbD在指导和改进产品的设计和生产过程以及帮助降低开发费用方面有着重要的作用。QbD的一个关键要素是实验设计(DoE )，它能够创建一个设计空间，并用于优化研究，以同时定义多个因素的交互作用的影响。DoE也是实验计划获取数据的有用工具，可对数据进行分析以获得合适的客观结论。

这项工作旨在根据Schott烧瓶中的上游DoE优化，确定该培养系统和台式搅拌罐生物反应器之间的相似性和差异。分析了携带蛋白G (BVG)和M (BVM)的狂犬病重组杆状病毒，以及从它们获得的使用Sf9昆虫细胞作为宿主的狂犬病VLP。这项研究的发现可以指导疫苗上游阶段的等效平台开发，使规模扩大在资源和时间方面更加经济实惠。

结论

目前的研究表明，在本文使用的条件下使用Schott烧瓶和台式生物反应器等同于重组杆状病毒在Sf9细胞中的感染过程。根据结果，两种培养系统中的流体动力学和化学差异似乎主要影响病毒和病毒样颗粒的稳定性以及它们产生后的完整性。需要进行旨在调整两个系统中的操作参数的未来工作，以获得类似的性能并提高Schott烧瓶的可扩展性。然而，Schott烧瓶是用于筛选和优化涉及用于产生狂犬病VLP的单顺反子杆状病毒感染和共感染的关键参数的合适培养系统。需要进行进一步的研究来评估颗粒的免疫原性，以便我们生产的VLP可以用作疫苗候选物。我们的研究小组打算通过体外和体内试验来进行这些研究，以分析VLP的免疫原性和抗原能力，以确保我们正在生产能够产生保护性反应的狂犬病病毒样颗粒。

Guardalini LGO, Cavalcante PEDS, Leme J, Mello RG, Bernardino TC, Jared SGS, Antoniazzi MM, Astray RM, Tonso A, Fernández Núñez EG, Jorge SAC. Performance Comparison of Recombinant Baculovirus and Rabies Virus-like Particles production Using Two Culture Platforms. Vaccines (Basel). 2022 Dec 24;11(1):39. doi: 10.3390/vaccines11010039. PMID: 36679884; PMCID: PMC9867115.