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看得见的DNA测序 精选

已有 10119 次阅读 2009-4-13 21:42 |个人分类:科研笔记|系统分类:科研笔记| 基因组, DNA测序, 医学, 荧光, FRET

  下午听了美国休斯顿大学生物与生物化学系杜晓春(Shiao-Chun(David) Tu)教授关于单分子实时DNA测序的报告,实时单分子DNA合成测序法(Single-Molecule Real-time DNA Squencing),觉得挺有趣,之前也听小鱼讲过类似的研究,所以感觉也比较熟悉。杜教授主要研究酶学,几十年来都致力于荧光、生物发光等研究,单分子DNA测序也是他工作的内容之一,在跟同事开公司的期间还取得了几项专利,现在公司已经被其他大公司购买,在单分子测序方面投入了更多的资金用于研发和推广。这篇博文主要是根据这次讲座整理的。

人类基因组计划的完成,让人们对于自身有了更多的认识,人类基因组由23条染色体,约30亿对核苷酸的DNA分子构成,其中1.5%(大约2-3万)为编码蛋白质的基因,此外还有很多非编码序列。分析基因组序列,对于认识各种基因的功能,了解基因表达的调控方式,理解生物进化的基础,进而阐明所有生命活动的分子基础无疑具有十分重要的意义。从基因水平深入理解疾病的发病机制,将为疾病的发生、发展、诊断和治疗提供新的手段,使个体化医疗成为现实。

DNA测序的发展有赖于基因工程技术的进步,1975-1985年的Sanger法可以称为第0代测序法,是DNA链末端合成终止法,基本原理是利用4种ddNTP代替dNTP作为底物进行DNA合成反应。一旦ddNTP掺入到DNA链中,由于核糖的3位碳原子上不含羟基,不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键,因此反应终止。用放射性P或S标记dNTP,电泳分离片段,放射自显影,就可以读出一段DNA的序列。

1st Generation:1986-2006,Dye-terminator sequencer,荧光代替了同位素。

2rd Generation:2006-present,sequencing by sythesis。

3rd Generation:in 2-5years,real-time single molecule sequencing。

4th Generation:5-10?years,direct sequencing。

从最初的全基因组测序花费300million美元(比预算3billion少很多),到后来历时9个月花费30million,技术不断进步,成本也在逐渐降低,但是离人们期望的在1天之内甚至几小时之内完成3billion bp的测序花费在1k美元左右的目标还相差很远,传统的测序方法显然不能满足人们的需求。

目前比较新的sequencing technology主要有以下几种:

Approach                   Key steps

Ligation(SOLID) Hybridization+ligation/Amplification/Serial   fluorescence

Base Extension  Pyrosequencing/Amplification/Serial  bioluminescense

SM Base Extension  Nanopore       conductivity

                                    Dye on base  fluorescence,ZMW

                                   Dye on r-Pi/Real-time  FRET

杜教授他们的研究是最后一种,应用FRET的方法,荧光标记在第三个磷酸分子上。FRET就是Fluorescence Resonance Energy Transfer (荧光共振能量转移),原理如图

FRET有两个条件:波长有重叠;合适的距离。energy transfer的efficiency与距离有关,如图

R。通常为20-40À。

杜教授他们应用的DNA测序方法是在DNA合成酶polymerase上标记donor,在第三个磷酸上标记acceptor,当标记了荧光的dNTP掺入到DNA分子中时,polymerase的donor把能力传递给dNTP的acceptor,donor的荧光强度降低,而acceptor的荧光强度升高,dNTP掺入后,Pi解离下来,所以不会影响下一个碱基掺入时的荧光变化,所以这种方法测序不用测一个就停下来,虽然目前由于技术限制故意放慢了DNA 合成的速度。现在正在研究试图利用多通道高通量的方法进行测序,那样就有可能在1天之内完成3billion的测序。他们现在的方法属于第2代、第3代测序方法,将来可能会出现直接测序,就是利用酶的构象变化conformational change直接测序,那样就不需要标记荧光,完全是在自然的情况下进行测序,会更简单更快速,当然技术要求也更高。



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