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培养组学(2):人类微生物群培养的取样和保存

已有 2866 次阅读 2021-11-18 12:36 |系统分类:教学心得

培养组学(2):人类微生物群培养的取样和保存

纯培养是破译特定微生物和/或微生物群在宿主健康中的作用的关键步骤。尽管宏基因组学已经彻底改变了对人类微生物群的研究,但它仍然不能轻易区分物种之间的菌株,也不能为进一步的研究提供生物材料。因此,纯培养仍然是表征微生物在健康和疾病中的相对作用不可或缺的一步【1】。目前,培养组学(Cultureomics)已经形成有效的工作流程(图1),与临床微生物学实验室之间共享MALDI-TOF(MALDI- TOF mass spectrometry)数据库,促进了从临床标本中识别潜在病原体的能力。培养组学是利用多种培养条件来进行培养细菌的方法, 生物体的生存能力取决于多个因素,其中,如运输时间、储存期、温度,以及确保维持微生物生存能力的特定储存系统等也是十分关键的【2】。下面简单介绍环境以及临床微生物学家对培养组学的贡献,主要是在微生物群培养的取样和保存阶段所在的努力。

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Fig. 1: The culturomic workflow. 培养组学最初设计用于在肠道微生物群中识别新的细菌物种,但后来被应用于其他微生物群,如人类阴道和尿液微生物群。培养组学的第一步是对样本进行分割,并将样本分成不同的培养条件a部分)。培养条件旨在抑制大多数群体的培养,并促进低浓度下挑剔微生物的生长(b部分)。然而,有针对性的培养条件被用来恢复特定的分类群。培养组学的一个重要特征是快速(<1 小时)通过MALDI-TOF质谱进行鉴定,该质谱依赖于分离物的蛋白质质谱与可升级数据库的比较(c部分)。如果鉴定失败,则对分离物进行16S核糖体RNA(rRNA)测序(d部分)。如果有与最接近的官方菌株有<98.65%的相似性,该菌株可能是一个新种。基因组测序证实了新分类群的发现(e部分),并使用分类基因组学(taxonogenomics对细菌进行正式描述。所有鉴定结果均与包含从人类身上回收的细菌物种的数据库进行比较。通过培养组学鉴定新物种增加了与人类相关的细菌种类(f部分)。

1.背景

2.人类微生物群培养的取样和保存

3.文化组学到位和取得的进展

1.背景

自17世纪首次记录以来,与人类相关的微观生命形式的发现一直吸引着科学界。随后微生物的分离和培养刺激了医学的巨大飞跃,包括抗生素的发现、传染病病原体的鉴定以及疫苗的开发。认识到显微镜下细胞计数的数量与实验室中可以生长的细胞数量之间存在巨大差异,促使基于测序的方法出现,以表征微生物群的未培养部分,导致对其组成和所有身体表面假定功能的前所未有的看法。很快就很明显,微生物群的特定成员可以成为我们的共生伙伴,对健康的各个方面产生新的影响,同时也是治疗化合物和生物技术工具的丰富来源。然而,利用大量的微生物特性,无意中需要纯培养来验证和操纵候选基因、蛋白质或代谢途径,正如哺乳动物细胞培养已成为了解宿主生物学机制不可或缺的工具. 然而,这种对单独或联合培养微生物的新兴趣由于传统培养方法的艰苦性质而停滞。通过实施改进的培养基设计和新的培养技术---来解决这一培养组学---未满足的需求,可以说有助于实现转化微生物组研究的未来里程碑【2a】。

从1861年巴斯德对发酵的研究到20世纪末分子方法的引入,培养一直是建立微生物与人类疾病之间联系的唯一直接技术。临床微生物学中分子方法的出现导致了大多数临床微生物学实验室已逐渐放弃培养,宏基因组学已成为评估共生微生物对人类健康影响最常用的技术【2,3】。然而,环境微生物学家重新引入了培养技术,使临床微生物培养已经在涉及挑剔微生物的传染病方面取得了重大进展,一种高通量培养方法,微生物培养组学,已被开发用于研究人类肠道微生物群。因此,培养组学使从人类肠道培养的已知细菌数量翻了一番【4】。同时,人类微生物群与各种疾病的关系也成为一个热门话题。这解释了为什么近年来对共生微生物的兴趣急剧增加。

下一代测序技术(next-generation sequencingNGS)的出现使人们能够更好地探索并因此更好地理解人类微生物群。事实上,NGS允许相对快速的分析,已经很快取代了非常挑剔的标准培养技术。NGS允许生成大量数据集,并将生物失调与越来越多的疾病联系起来。然而,这些方法受到所使用实验方案的异构性的限制,如提取方案和引物的可变性缺乏标准化,所有分子方法相关的深度偏差,导致少数物种被忽视,缺乏关于生存能力的信息,以及可用于进一步实验的菌株【5-7】,因此,可以获得不同的结果。同时,生物信息学分析提出的各种方法(例如,操作分类单元聚类、分类分配或统计分析)可能会对结果产生重大影响。所有这些限制都强调了回归依赖培养的方法并辅以独立于培养的方法的必要性。培养组学概念于2012年为此创建【8】。从那时起,许多研究将高通量培养与宏基因组学相结合,并通过分离和测序以前未培养的物种来减少与宏基因组学相关的暗物质【9】。

2.人类微生物群培养的取样和保存

取样是人类微生物群研究的重要步骤。过去和当前的研究表明,保护方法对通过依赖于培养的方法获得的结果有很大影响【9,10】。目前,粪便样本收集和保存的方法和程序缺乏共识,尤其是如果设想进一步的下游宏基因组应用。在微生物群分析的最初步骤中,样品操作和其他相关程序可能是最具影响的变量之一【11】()。2017年,Gohl及其同事报告了元基因组分析过程中错误和偏差的不同来源【12】()。值得注意的是,他们将样本收集和储存确定为两个步骤,这两个步骤直到现在还没有方便地解决(图2)。样品的采集方式必须能够捕获微生物群落的全部组成,并加以保存和稳定,以防止基因组材料的生长或降解。其次,必须有效地从这种多样的生物体集合中提取DNA,这些生物体可能具有广泛的膜特性和生理状态(例如孢子、生物膜),对许多提取过程来说可能是不可接受的【12】

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图2    Steps in the microbiome data generation process and technical sources of error and bias at each step【12】. 

不同的研究方案对微生物种群的最终估计以及是否进行转录组学和代谢组学等补充研究的能力产生了巨大影响【13】(表1和2)。20°C或80°C用于试验前的样品储存。80°C,通常用于长期储存,被认为是样品保存的黄金标准,特别是关于冷链【11】。对于短期储存,制冷(4°C)就足够了,而不是在室温下储存【14】。样品也可以在冷冻干燥后保存,在某些情况下用于粪便微生物群移植【15】。然而,冷冻干燥对细胞来说是一个破坏性的过程,极大地影响了样品的生存能力。已经描述了分别添加保护剂,如双糖、多元醇和蛋白质【16】,或如最近的研究所示,添加上述所有物质的组合【17】,以提高冷冻干燥后粪便中细菌的生存能力。

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表1。适用组学技术概述、优点和缺点,以及根据对表2中不同储存方法的显著影响的解释和建议

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2。与立即冻结(在-20°C-80°C下)相比,不同储存条件对α多样性测量(丰富度、均匀度、香农多样性指数(SDI))、β多样性测量(如unifracBrayCurtis不相似性(BC))和分类群丰度的显著影响。

当应用于特定的细菌群落时,只有应用不同方案的总DNA提取步骤产生不同的结果,突出了细菌裂解(酶解、机械或两者)纳入最终结果的偏差。考虑到这一点,似乎很难想象仅仅使用不同取样方法的微生物组研究结果如何进行比较【11】。如果考虑到细菌的生存能力,特别是对专性厌氧菌种群的影响,粪便样本采集和运输过程中的氧毒性等变量可能会产生更大的影响。维持这些极端氧敏感(extreme oxygen sensitive,EOS)细菌的生存能力是设计基于微生物群的疗法的关键因素,例如自体或异种粪便微生物群移植(分别为aFMT或FMT)【18,19】。

由于DNA稳定性一直是主要微生物组项目关注的主要焦点,很少考虑氧毒性的影响,即使众所周知,粪便样本中存在的许多EOS细菌在暴露于大气氧浓度下几分钟后死亡,因此有必要在厌氧条件下对其进行操作【20】。因此Martínez等设计了一款用于在粪便取样期间维持微生物生存能力的一次性设备【11】(图3)

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3.  GutAlive,粪便取样和运输用粪便收集工具包及其组件。

图3显示了Martínez等设计一个工具包GutAlive。值得注意的是,GutAlive的使用期限为24-48天在室温下对粪便进行取样并运送至实验室的时间,而不会显著降低细菌活力。室温下的稳定性(RT)有望改善和增强目前用于FMT/aFMT的方案,该方案至今缺乏共识,有时包括在家用冰箱中冷冻样品【5】。为了更好地理解GutAlive提供的改进,Martínez等将所有结果与广泛用于粪便取样的传统设备进行比较【11】。专性厌氧菌和EOS细菌的生长和存活见图4,总的来说,这两项检测探测到GutAlive能够产生一种方便的厌氧环境,支持专性厌氧菌的生存和生长。

由于GutAlive对处理专性厌氧菌/EOS细菌非常有效,我们调查了该设备是否能够在采样和输送过程中保持微生物群的活力(生存能力和多样性),这是大多数微生物研究的前两个步骤。将两个装置打开至厌氧工作站,在最大回收稀释液上进行连续稀释,并将其摊铺到4种不同的预还原培养基GAMc、mBHI、mBHIb和ABMb的表面上:(图5)。GutAlive设备能够防止在传统容器中观察到的可培养细菌多样性松动,即使在24小时后、 根据所考虑的生长介质,将多样性指数保持在2.5–3.8左右。相比之下,传统粪便收集装置的细菌多样性指数明显较低(24小时时为1.3–2.8)【11】。

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4。(A 将双歧杆菌液体培养物添加到粪便样本中,并在常规粪便取样装置或GutAlive中培养,以在24小时后通过计数(CFU/mL)评估存活能力 h72 HGutAlive能够在72小时内将双歧杆菌LMG11041的存活率维持在90%以上 h与初始时间点相比(对照组,t = 0 h 而在传统设备中,前24小时的生存率为66% 72小时后无细菌恢复

B prausnitizii粪杆菌接种在培养液中,并在常规粪便取样装置或GutAlive中培养,以监测48小时以上的生长(OD600 GutAlive能够支持prausnitzii F.M21/2的生长(OD600~1.5),M21/2菌株的生长曲线与厌氧工作站中获得的生长曲线相似(数据未显示)。而在传统粪便收集装置中未观察到生长。

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图5。从采样时刻开始,在5和24小时后使用四种不同培养基回收可培养细菌时,使用GutAlive收集和取样粪便样本的效果。结果与传统粪便取样装置的使用进行了比较。

使用常规粪便收集装置减少细菌多样性可能与氧气的存在有关,氧气杀死专性厌氧菌,同时有利于兼性厌氧/耐气微生物的存活。氧对优势微生物种群的毒性在过去几年中得到了广泛的研究。在这方面,Albenberg及其同事证明了微生物群成员的梯度分布与肠道组织向管腔内的氧气灌注有关,并且表明与直肠粘膜相关的耐氧蛋白细菌和放线菌物种的患病率较高【21】。同样,肠道炎症期间,由于腹泻患者高水分粪便中的氧化代谢物和氧气含量较高,耐气微生物数量增加【22】。值得注意的是,炎症性肠病(IBD)的特征是微生物群的特征性失调,其中专性厌氧菌极度减少,有利于兼性厌氧菌的增加,例如,由于含氧量较高,普氏杆菌减少,大肠杆菌增加【23】。

使用不同的粪便收集设备和策略对取样和运输后在实验室回收的粪便微生物群的生存能力和多样性有着深刻的影响。如果样品的目的是设想个性化的治疗目的,例如aFMT或定制生物疗法的设计,则氧毒性尤其重要【24】。一旦盖上盖子,便会在粪便容器中产生厌氧环境,以去除内部大气中的氧气,从而将氧气暴露和对厌氧细菌的毒性降至最低。对于不考虑避免氧中毒的常规粪便取样装置,应预计主要和有意义的EOS细菌,如粪便杆菌,在暴露于大气氧浓度下数分钟后将死亡【25】。

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6.  所用方案示意图。常规方案(黑色箭头):粪便暴露于氧气中超过1小时,无任何保护剂介质。优化方案(蓝色箭头):将粪便暴露在氧气中超过1小时,并保存在保护剂培养基中。实施的优化方案(红色箭头):粪便暴露在氧气中不到2分钟,保存在保护剂培养基中,所有操作均在厌氧室内进行。通过流式细胞术(FCM)和平板计数法(CFU)对细菌细胞进行计数。

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7. 通过流式细胞术(FCM)(死亡、活的和受伤的细菌)和菌落形成单位(CFU)计数(需氧菌和厌氧菌)在三个方案中进行的总细胞计数。从粪便样本中的总细胞和FCM计数的活细胞计数可培养性百分比。使用MannWhitney检验突出了两种方案之间的显著差异。

Bellali等【26】研究了大气氧气对细菌生存能力和培养能力的影响,通过流式细胞术(FCM)和平板计数法(CFU)评估了三种不同类型的粪便样品处理(图6),结果显示,在没有任何保护剂培养基的情况下暴露于氧气中120分钟时,培养的细菌产量达到50%,而在抗氧化剂存在的情况下,可培养性的百分比增加到67%。更重要的是,当样品暴露在氧气中不到2分钟,再加上厌氧室下的工作,两种计数技术之间没有发现不一致,可培养性增加到87%(图7)。研究证实了样品预处理对保持样品中细菌活力的重要性,尤其是对氧敏感的肠道细菌【10,26】。暴露在氧气中,即使是2小时,也会显著降低样本的生存能力。事实上,通过缩短采样和培养之间的时间【26】或使用GutAlive设备或保存介质来限制接触氧气【11】,有助于分离挑剔的物种【14】。之后,Bellali等【17】评估了冷冻干燥前保护剂培养基(含蔗糖(10%)、海藻糖(10%)、脱脂乳(10%)和抗氧化剂)在不同储存条件下对肠道细菌活力的影响。通过平板法评估细菌活力的结果表明,无论储存条件如何,保护剂培养基对两种菌株的存活率(85–93%)均高于生理盐水溶液(0.36–37.50%)。细菌的大小和形状在保护剂培养基中保持不变。相反,在没有保护剂培养基的情况下储存会严重破坏细菌形态(图8)。

因此,储存条件和取样的改善可以培养出挑剔且对氧极为敏感的细菌,如prausnitzii粪杆菌,并提高人体样本的产量【9】(图9)。

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8。图解说明为评估(a)盐水和(b)保护剂培养基在冷冻和冷冻干燥后对细菌活力的影响而制定的方案设计的示意图。(i 在单个细菌上,嗜粘液阿克曼菌和大肠杆菌。(ii 在粪便样本上。采用平板法、流式细胞术和扫描电镜对细菌活力和细胞完整性进行评估。

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9:提高样品贮存率。人类临床样本的收集和储存条件可能会影响微生物的生存能力(A 短时间暴露于感兴趣样品的氧气中可提高生存能力【26】;(B 市售采样试剂盒可用,并已证明对挑剔微生物的生存能力有效【11】;(c)更好的替代方法是在冷冻保存前对样品进行培养【16】;(DE)人类临床标本主要采用冷冻保存或冷冻干燥方式保存;添加冷冻保护剂或保护剂培养基可以在解冻后获得更好的产量【1617】。

3.文化组学到位和取得的进展

Lagier【1,4,6】的团队意识到将更多环境微生物的细菌分离物引入培养的迫切重要性,引入了“培养组学”战略。他们开发了一种高通量培养策略,利用MALDI-TOF-MS和/或16S rRNA扩增和测序来研究人类微生物群,以识别生长菌落。培养组学的原理基于各种生长培养基、培养条件、气和培养时间的多样化和多重组合,这些组合减少到只有18种培养条件,以标准化培养组学,并补充培养依赖和培养独立分析【6】。 Lagier等人确定>1000个原核物种,从而增加>500种代表人类肠道中已知微生物总数增加50%。此外,他们能够在没有外部氢源的情况下扩展古细菌的可培养性,以恢复人类古细菌物种【27,28】。

 

3.文化组学到位和取得的进展

Lagier【1,4,6】的团队意识到将更多环境微生物的细菌分离物引入培养的迫切重要性,引入了“培养组学”战略。他们开发了一种高通量培养策略,利用MALDI-TOF-MS和/或16S rRNA扩增和测序来研究人类微生物群,以识别生长菌落。培养组学的原理基于各种生长培养基、培养条件、气和培养时间的多样化和多重组合,这些组合减少到只有18种培养条件,以标准化培养组学,并补充培养依赖和培养独立分析【6】。 Lagier等人确定>1000个原核物种,从而增加>500种代表人类肠道中已知微生物总数增加50%。此外,他们能够在没有外部氢源的情况下扩展古细菌的可培养性,以恢复人类古细菌物种【27,28】。

 

主要参考文献

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3. Arch Med Res 2017 Nov;48(8):774-779

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7.  Sci Rep 2016,6:26276

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13. FEMS Microbiol Rev. 2017 Aug 1;41(Supp_1):S154-S167.

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22. Bowel Diseases 2012,18, 968–980

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27. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2016,35, pp. 985-991

28. Adv Res. 2019 Apr 19;19:15-27.

29.  培养组学(Cultureomics)需要遍地开花吗?

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