博文
从衰老本质到生命本质
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不久前承诺，将在科学网介绍我们的“广义衰老学说”，实际上也就是介绍我们那个所谓的关于“衰老本质”的解读。关于这个问题的思考和探索虽然汇聚了我们‘几十年磨一剑’的积累和努力，但论文本身的完成却是在雅典奥运的激励下，在2004年暑假的三伏天挥汗而成——多么渴望为中华民族增添科学的奥运金牌啊！
记得当年带着盛夏的满腔热情投往《中国科学》，审稿拖了半年，起先说国内找不到合适的人审稿（这也难怪，写稿的是国内的珠穆朗玛，哈），后来说编辑回家生孩子，反复催问后，最后以莫须有的名义被拒。无奈之下，终而只好在2005年夏投往国外的杂志发表。该文表面看是研究和解读衰老过程的机理与本质，实际上涉及了生命的本质。记得几年前北大医学部童坦君院士夫妇曾经就衰老的超复杂性有过如下名言：“衰老本质就是生命的本质，衰老机理讲清楚了生命的本质也就讲清楚了”。
五年过去了，对于衰老本质的解读，专业领域（生命科学小同行）已经逐渐达成共识，生命科学大同行仍在鱼龙混杂的‘泥浆浴’中挣扎。为科学进步，只好在这里再次炒冷饭。为方便大家阅读，中文版直接以word形式贴出，英文版以附件的形式附在文章后面。然而，我们对于生老病死过程的更加深刻地思考和认识，发生在该文发表之后的近年（有兴趣的读者，且听下回分解）……
（图不便上传，可参见英文版中的图）
论衰老过程的生化本质
印大中，陈可冀
一、前言
当前，生命科学有关衰老机制的研究，正处于百花齐放、硕果累累的时期(Comfort, 1979; Medvedev, 1990; Hayflick, 1998; Kirkwood, 1999; Warner, 2005; Yin & Chen, 2005)，然而，由于衰老过程极其复杂，影响因素千变万化，又由于各个领域研究工作者的知识局限和专业偏见，我们实际面临的是一个鱼龙混杂，莫衷一是的混乱局面(Medvedev, 1990; Olshansky et al. 2002; de Grey et al., 2002; de Magalhaes, 2005)。
在这篇论文中，我们将首先简明地回顾有关衰老机理研究的重要进展，探讨在衰老过程中，遗传基因调控与不可避免的环境因子损伤的相互作用。接着，我们强调指出，为了研究真正意义上的衰老过程，应该将注意力集中在健康状态下的种种生理性老化改变，而不是病理性变化。例如，生物体内蛋白质的增龄性损变是一个最为普遍存在的老化现象。在详细阐述自由基氧化和非酶糖基化生化过程，以及熵增性老年色素形成生化机理后，重点探讨了羰基毒化（应激）在衰老过程中的特殊重要意义（Yin & Brunk,1995）。最后，透过现象看本质，提出生化副反应损变失修性累积是生理性衰老过程的生化本质。
二、衰老理论概述和对衰老机理研究的总体评论
大量的生命现象和实验事实提示，尽管少数低等动物的死亡显示出有一些神秘的“生命开关”在起作用，但衰老过程，尤其是高等动物在成年后的衰老过程已被清楚地认识到是一个受环境因素影响的缓慢渐进的损伤和防御相拮抗的过程。大量现行的重要的衰老研究成果都无可争辩地显示了这一点(Comfort, 1979; Medvedev, 1990; Hayflick, 1998; Yin, 2002)。为了便于分析和讨论，我们首先列出数十种迄今最为重要的衰老学说：
整体水平的衰老学说主要有：磨损衰老学说(Sacher 1966)、差误成灾衰老学说(Orgel 1963)、代谢速率衰老学说、自体中毒衰老学说(Metchnikoff 1904)、自然演进衰老学说（程控学说）、剩余信息学说（程控学说）、交联衰老学说;
器官水平的衰老学说有：大脑衰退学说、缺血损伤衰老学说、内分泌减低衰老学说(Korencheysky, 1961)、免疫下降衰老学说(Walford 1969)；
细胞水平的衰老学说有：细胞膜衰老学说(Zs.-Nagy, 1978)、体细胞突变衰老学说(Szilard, 1959)、线粒体损伤衰老学说(Miquel et al., 1980)、溶酶体（脂褐素）衰老学说(Brunk et al., 2002)、细胞分裂极限学说（程控学说）；
分子水平的衰老学说有：端粒缩短学说（程控学说）、基因修饰衰老学说、DNA修复缺陷衰老学说(Vilenchik, 1970)、自由基衰老学说(Harman, 1956, 2003)、氧化衰老学说(Sohal & Allen, 1990; Yu & Yang, 1996)、非酶糖基化衰老学说(Cerami, 1985)、羰基毒化衰老学说(Yin & Brunk, 1995)和微量元素衰老学说(Eichhorn, 1979)等等。
其它重要的衰老学说还有熵增衰老学说(Sacher 1967, Bortz, 1986)、数理衰老学说和各种各样的综合衰老学说(Sohal, 1990; Zs.-Nagy, 1991; Kowald & Kirkwood, 1994)。从上述26种主要的衰老学说可以初略的看出绝大多数衰老学说（22种）认为，衰老是因生命过程中多种多样的外加损伤造成的后果。简言之，是一个被动的损伤积累的过程。
应该说明的是在4种归类为“程控学说”的衰老理论中，细胞分裂极限学说和端粒缩短学说所观察研究的所谓“细胞衰老”与动物整体的衰老有着很大的差别。就“细胞不分裂”这个概念本身而言，并不是“细胞衰老”的同义词。解释很简单，终末分化的神经细胞和绝大多数肌肉细胞在生命的早期（胎儿或婴儿）时期完成了分化以后，便不再分裂，却仍然健康的在动物体内延用终身(Sohal, 1981; Porta, 1990)。近来Lanza等甚至用体外培养接近倍增极限的胎牛二倍体成纤维细胞作为供核细胞成功地培育出了6只克隆牛(Lanza et al., 2000)，所述的6只克隆牛的端粒比同龄有性生殖牛还长。其实，从衰老过程的常识（或定义：衰老是生物体各种功能的普遍衰弱以及抵抗环境伤害和恢复体内平衡能力逐渐降低的过程）的角度来讲：端粒缩短与细胞和整体动物的增龄性功能下降基本无关。因篇幅所限，本文不作详谈(Wakayama et al. 2000; Cristofalo et al., 2004)。
生命科学对于遗传因子与环境损伤各自如何影响衰老进程的认识经历了漫长的“各自为证”的阶段。经过遗传生命科学家几十年的辛勤探索，现已实验确定的与衰老和长寿有关的基因已达几十种(Finch & Tanzi 1997; Warner, 2005;)，例如：age-1, Chico, clk-1, daf-2, daf-16, daf-23, eat-2, gro-1, hsf-1, hsp-16, hsp-70, Igflr+/-, indy, inR, isp-1, KLOTHO, lag-1, lac-1, MsrA, mth, αMUPA, old-1, p66sh, Pcmt, Pit-1, Prop-1, ras2p, spe-26, sag, sir2, SIRT1, sod1 基因等等(Hamet & Tremblay, 2003; Warner, 2005)。这些寿命相关基因可被大致分为四类：1）抗应激类基因（如，抗热休克，抗氧应激类）；2）能量代谢相关基因（如，胰岛素/胰岛素因子信号途径，限食或线粒体相关基因）；3）抗损伤和突变类基因（如，蛋白质和遗传因子的修复更新等）；4）稳定神经内分泌与哺乳动物精子产生的相关基因等。好些“寿命基因”的生物学功能目前还不是很清楚。
另外，研究发现的与细胞分裂和衰老相关的细胞周期调控因子有CDK1、PI3Ｋ、MAPK、IGF-1和 P16等等(Wang et al., 2001; de Magalhaes, 2005)。因此，生命科学家已经清醒地认识到确有与衰老和长寿相关的基因，但掌管寿命长短的遗传因子不是一个或几个，也不是一组或几组，而是数以百计的遗传因子共同作用的结果(Holliday, 2000; Warner, 2005)。衰老过程是与生理病理相关的，在调控、防御、修复、代谢诸多系统中的多个基因网络共同协调，抵御种种环境损伤的总结果。总之，衰老是先天（遗传）因素和后天（环境）因素共同作用的结果，已逐渐成为衰老生物学研究领域公认的科学事实。
认清了动物衰老的上述特征，关于衰老机制的研究便可理性地聚焦在（分子层面上的）损伤积累和防御修复的范围之内。
三、衰老的生理性特征和潜藏的分子杀手
为了讨论真正意义上的衰老机制，有必要对衰老和老年疾病作较为明晰的界定。一般来讲，学术界普遍认同：衰老不是一种疾病。衰老机制主要研究的是生物体健康状态下的生理性老化改变。
考虑到衰老过程是一个普遍存在的、渐进性的、累积性的和不可逆的生理过程,因此造成生理性衰老的原因应该是有共性的损伤因素(Strehler, 1977)。这些因素造成的积累性的，不可逆的改变才是代表着实际意义的衰老改变。
其实无论是整体水平、器官水平还是细胞水平的衰老改变归根结底还是分子水平的改变，是分子水平的改变分别在不同层次上的不同的表现形式而已。许多非疾病性衰老改变，例如增龄性血管硬化造成的血压增高，又例如胶原交联造成的肺纤维弹性降低和肺活量下降，还有皮肤松弛，视力退化，关节僵硬等等都隐含着生物大分子的内在改变(Bailey, 2001)。这些改变从整体和组织器官的角度来讲不算生病，但分子结构已经“病变”了。例如，蛋白质的交联硬化就是一个最为常见的不断绞杀生命活力的生化“枷锁”，即使是无疾而终的老人，体内蛋白质的基本结构与年轻人的相比也早已面目全非了。生物体内蛋白质的增龄性损变和修饰是一个普遍存在的老化现象。衰老的身体，从里到外、从上到下都可观察到增龄性的蛋白质损变。
当然，许多学者会毫不犹豫地赞同，基因受损应该是导致衰老的重要原因之一。然而，‘衰老过程为体细胞突变积累’的假说却遭到了严谨的科学实验无情地反驳，例如，辐射损伤造成遗传因子突变在单倍体和二倍体黄蜂(wasp)身上应该造成明显的寿差，但研究结果表明，DNA结构遭受加倍辐射损伤的二倍体黄蜂的寿命与单倍体黄蜂相比没有出现显著性的寿命差别，否定了上述推测 (Clark & Rubin, 1961; Lamb, 1965)。另外，大量的生物医学研究表明，衰老过程中DNA损伤和突变的增加主要导致病理性改变(Bohr, 2002; Warner, 2005)，比如，造成各种各样的线粒体DNA的疾病(Holliday, 2000; Wallace, 2003)以及癌变的产生等。考虑到衰老过程明显的生理特征，蛋白质的增龄性损伤和改变则显然比遗传物质的损伤、变构对“真正衰老”做出了更多“实际的贡献”(Kirkwood,1999; Ryazanov & Nefsky,2002; Yin & Chen, 2005)。
另外，Orgel (1963) 提出的“差误成灾衰老学说”认为：衰老是生物体对‘蛋白质合成的正确维护的逐渐退化’也遇到了科学实验的强烈挑战而基本被否定(Gallant & Palmer 1979; Harley CB et al., 1980)。Harley等人(1980)的研究表明：‘体外培养的人体成纤维细胞在衰老过程中蛋白质的合成错误没有增加’（注意，对于蛋白质来说，氧化应激几乎为无孔不入和无时不在的生命杀手）。进而，该领域的科学家们越来越清楚地认识到,蛋白质的表达后损变才是生命活动和衰老的最主要的表现。因为与衰老相关的蛋白质变构在衰老身体的各个部位比比皆是（如身体各器官组织的增龄性纤维化和被种种疾病所加速的纤维化），而且组织内蛋白质的衰老损变是最终的也是最普遍的衰老现象。事实上，老化蛋白质损伤几乎在每个衰老假说中都有所涉及。因此，本论文的分析和讨论的重点将聚焦在蛋白质的损伤和修复与衰老的相关性等范畴。
总的来说，蛋白质的合成、损变与更新贯穿于整个生命过程中。在生命成熟以后，蛋白质的合成与降解（速度）处于动态平衡中。随着年龄增长，这个平衡逐渐出现倾斜(Bailey, 2001; Terman, 2001)。衰老的生物体细胞内无论是结构蛋白还是功能性蛋白质的损伤和改变的报道比比皆是(Stadtman, 1992, 2003; Rattan, 1996; Ryazanov & Nefsky, 2002)。细胞间蛋白质的老化改变和修饰的现象更是屡见不鲜。例如，大量显而易见的和典型的生理性老化改变是生化副反应在细胞间质组织（如胶原等）上的积累，如皮肤、眼睛、血管、肺叶、肾小球基底膜等组织的交联硬化，进而造成缓慢的、逐渐的、有器官特异性的、由量变到质变的身体功能的下降(Sell & Monnier, 1995; Rattan, 1996; Bailey, 2001; Stadtman, 2003)。
然而，什么是这些损变的罪魁祸首？
考虑到正常的衰老是一个普遍的，逐渐的，积累的和不可修复的生理过程，所以导致衰老相关结果的原因应该是一些普遍存在的损伤因子(Strehler, 1977)。体内能自发发生并造成普遍损伤并与衰老和疾病相关的生化反应主要包括以下两种类型(Baynes, 2000)：
自由基氧化损伤：氧化应激造成生物大分子生理和病理性损伤和修饰的累积是导致生物体病变和衰老的一类最常见的生化反应(Harman, 1981; Yu, 1996; Sohal, 2002)。
非酶糖基化修饰：这是与衰老相关的另一类极为重要的生化反应，与糖尿病造成的衰老和疾病有关(Cerami, 1985; Baynes & Monnier, 1989; Sell & Monnier, 1995)，因为无需生物酶（非酶）催化，所以可以自发进行。
在衰老过程中，还存在一些其它的与蛋白质翻译后修饰相关的重要反应，它们包括：异构化，消旋化，脱氨基化，巯基氧化，错误折叠，交联反应，DNA甲基化下降，组蛋白乙酰化失控，蛋白质降解减慢等等(Rattan, 1996; Baynes, 2000; Clarke, 2003)。与参与能量代谢过程的氧化和糖基化不同的是，自发的异构化和消旋化不是新陈代谢所需的和相关的，他们能够有效地被酶促生化反应清除。例如，L-异门冬氨酰残基和消旋的D-门冬氨酰残基能够被甲基转移酶识别和修复(Clarke, 2003)。在临床和实验上，老年医学研究也发现他们的形成在衰老过程中非常缓慢，而且并非扮演着重要的“麻烦制造者”的角色，因为他们不形成不可修复的聚合物。与衰老相关的DNA甲基化下降，脱氨基化，蛋白质降解和组氨酸乙酰化都属于酶促反应，因此应该属于衰老损变的后果，而非自发的衰老起因。巯基氧化，蛋白质的错误折叠和交联反应只是自由基氧化和非酶糖基化造成的损变在不同的研究领域和专业范畴的不同名称而已。
总之，自由基氧化与非酶糖基化是生物老化过程中最重要的两大类能够自发进行的伤害性生化反应。因为这些生化反应不属正常的生理生化过程，我们在文章中将用“生化副反应”来特别标示。实际上，上述两类生化副反应涵盖了与生物能量过程相关的损伤性修饰的主要途径，也代表了食物在储藏和加工过程中逐渐“老化”的主要生化过程(Bortz, 1986; Yin 2003)。
四、关于自由基衰老学说激烈的争论和非酶糖基化学说的重要性
1956年Harman在前人研究工作的基础上向科学界正式提出了自由基伤害衰老假说(Harman, 1956, 2003)。在自由基衰老理论所取得的主要成就中，比较有代表性的有如下几个方面(Halliwell & Gutteridge, 1999)：1) 自由基衰老理论从某种程度上解释了自由基与氧化应激造成的增加代谢率和加速老化的现象。2) 初步阐明了氧自由基对细胞及亚细胞器 (溶酶体、线粒体等) 造成的氧化损伤能够造成细胞的损伤以至细胞凋亡和老化死亡。3) 解释了动物种系的寿差与抗氧化能力（如组织自氧化速率）的相关性。4) 发现了氧自由基伤害能产生与脂褐素类似的荧光物质(Sohal, 1981; Yin, 1996; Szweda et al., 2003)。研究表明，几乎所有的疾病过程不管是急性病还是慢性病，都有自由基的参与。尤其重要的是，几乎所有与增龄相关的退行性疾病，无论是心脑血管疾病、癌症、老年痴呆、肾脏衰老还是糖尿病等都与自由基的存在及其造成的伤害有着千丝万缕的联系。这些老年疾病的病理生理表象为自由基伤害衰老理论的立足铸造了一个宽广的平台。
然而用自由基伤害衰老学说解释衰老机制有着许多的勉强之处，也遇到了不少实验结果造成的困惑和反驳。
越来越多的实验表明，自由基反应是生命化学的一个基本组成部分，是诸多生化反应的必然过程。例如，自由基反应是许多氧化酶、脱氢酶进行氧化还原反应的一个中间环节，是免疫过程中机体组织防御外来生物侵犯的‘御林军’。又例如，一氧化氮（NO）是一种氧自由基,也是一种神经递质,在动物体内担负着多种非常重要的生理功能和作用 (Tuteja et al., 2004)。由于自由基假说存在以下几个明显的缺陷而被Yu(1996)教授质疑：
1、引起氧化损伤的来源不局限于吸入体内的氧气产生的自由基离子。
2、自由基离子的产生与氧气消耗量或新陈代谢速率不呈现化学计量的正相关。
3、生物衰老或许不是由于氧自由基损伤导致的病理状态而造成的。
大量实验也表明：抗氧自由基和氧应激的药物不是‘长命仙丹’ (Tochopherol Group, 1994; Olshansky et al. 2002)。组织内的氧化还原是一个多抗氧化物质组成的平衡，体内维护该平衡的氧化还原物质相辅相成，环环相扣，彼此有取代性和补偿性。抗氧化酶类有的随龄增加,有的随龄下降,有的不随龄变化(Sohal & Allen, 1990)。
由于上述自由基衰老学说的种种问题，Sohal等提出了以 “氧化应激衰老学说” 来取代和修正自由基氧化学说。改革后的理论认为氧化应激才是衰老真正的原因(Sohal & Allen, 1990; Yu & Yang, 1996)。然而，最新的研究结果显示，氧应激与最大寿限并无直接相关性，因此，氧应激衰老理论也左右彷徨，进退两难，无法自圆其说。面对如此困境，Sohal教授试图用以下几个理由进行辩解(Sohal et al., 2002):
1, 活性氧产生于特异位点，并就近攻击不易受抗氧化剂保护的组织。
2, 对于让细胞保持生命活力的物质（如，抗氧化剂）的需求远远超过实际可能。
3, 在免疫应答或通过信息传导途径进行的基因表达调控过程中,一定量的活性氧物质的产生是有益的。
考虑到对于衰老机制的理解变得越来越复杂，我们建议用以下公式来阐述这个问题，理解了下述公式，解答错综复杂的衰老谜团，将变得轻松简单，一目了然（公式1）：
衰老性改变 (与最大寿限正相关) = 多种损伤 (包括氧应激) – 修复与更新 (包括细胞凋亡等)
(核心衰老过程) (所谓衰老起因与加速因子) (抗衰老抗应激过程)
公式1 . 简明衰老机理公式 （注意‘衰老机理’与‘衰老过程’的重要差别）
这是一个明智的生命科学工作者都会认可的简明衰老机理恒等式，但又是研究衰老机理过程中最经常造成混乱的一些概念。公式整体为‘衰老机理’，公式等号左边为‘衰老过程’，右边为‘衰老起因’等。应该注意的是：公式等号左边的‘衰老性改变’应该与‘最大寿限’正相关；而‘衰老起因’与‘衰老过程’则显然为两个不同的概念，分列在等式的两边！
公式清楚地表明，氧应激和相关损害既不与衰老变化直接相关也不与最大寿限直接相关，因为损伤值减去了修复与更新值才代表着与衰老相关的变化(Sohal et al., 2002; Park & Gerson, 2005；Yin & Chen, 2005)。一般而言，氧化损害引起急性病变，而不可修复的变化意味着生理的和慢性的组织改变，即衰变。这样就可以很好地解释为什么前面提到的研究无法把氧应激与最大寿限相关联(Sohal et al., 2002)。关于损伤物质积累的具体讨论将在后文展开。
实际上，氧应激损害是各种各样与衰老相关的生化副反应的表现之一。糖尿病患者则受害于由高血糖所导致的另一大类能自发进行的生化副反应所引起的衰老加速(Cerami, 1985; Monnier, 1990; Litchfield et al. 1999)。值得注意的是，与糖类相关的衰老过程基本上不依赖于氧化过程（例如，在开始阶段）(Yin & Brunk, 1995; Litchfield et al. 1999; Baynes, 2001)。这就是近年来老年生化机理的研究越来越多地注意到的另外一个重要的衰老机制——非酶糖基化衰老（简称糖基化衰老学说）。因为该学说也与生物的能量代谢过程息息相关，因此也是一个具有普遍意义的分子水平的衰老学说。该学说因为以美拉德首先研究报道的糖基化反应为基础(Maillard, 1912)，从糖尿病加速老化的现象中得到启发，因此也称之为糖基化/美拉德反应衰老学说。
研究表明，在生理条件下，葡萄糖能与多种氨基酸、多肽和蛋白质中的氨基发生反应，生成薛夫碱 (Shiff bases)，薛夫碱则可发生分子内的重排而生成较为稳定的阿马多里 (Amadori) 重排产物(Maillard, 1912; Hodge 1953; Cerami, 1985)。该产物的进一步降解，如脱氨、水解则可产生脱氧邻酮醛（deoxyosone）等不饱和醛酮类中间产物(Thornalley et al., 1999; Baynes, 2000)。这些中间产物不仅与脂肪氧化过程所产生的不饱和醛酮类中间产物结构上相似，而且其产生毒害反应的活性和最终产物也很相似，如它们与蛋白质和核酸中的氨基交联共轭，聚合重叠，结成千奇百状、发黄褐变的生物垃圾、荧光色素等(Baynes, 2000; Metz, 2003)。这些产物目前被笼统地称之为糖基化终产物 (AGEs)，其中包括嘧啶﹑吡咯，也有吡嗪(Hayase, 1989)、咪唑以及它们与生物分子的聚合物。
该学说指出：非酶糖基化造成的蛋白质的交联损伤是衰老的主要原因。糖基化造成的蛋白质的交联硬化和逐渐变性是造成血管、肾脏、肺叶和关节提前老化的关键因素(Monnier, 1990; Miyata et al, 2003)。与糖类分子结构中的羰基发生反应的氨基酸残基主要有赖氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸以及苏氨酸等(Stadtman, 1992, 2003)。由此造成结构蛋白的硬化，功能蛋白的损伤，如抗氧化酶和DNA修复酶的增龄性损变等。还会造成能量供应的减少，代谢功能的降低，平衡机能的失调等等老化现象(图I)。
图I. 衰老过程中生化副反应失修性累积与老年色素的主要生化形成机制
因为自发产生的非酶糖基化反应的速度相当慢，另外，许多糖基化反应的实验是在有氧的条件下完成的，与氧自由基相关的氧化过程时时刻刻都可能加速和伴随非酶糖基化反应的进行，因此非酶糖基化和氧化应激衰老过程有着千丝万缕的关系(Monnier 1990; Baynes, 2000；Yin, 2002)。
1992年,当时的美国老年协会主席Yu(1992)教授提议把自由基氧化与非酶糖基化反应结合成一套新的衰老理论——自由基-美拉德反应衰老学说。因为这样将能形成这两种衰老学说的理论上的互补，从而解释许多目前还不能解决的衰老机理方面的问题。
五、 氧应激和不饱和羰基在衰老过程中的关键作用：
根据自由基理论，衰老和与之相关的许多退行性疾病主要归结于氧自由基对细胞组分的有害性攻击，攻击对象包括：染色体，线粒体DNA和功能蛋白质和结构蛋白质例如，细胞间质和结缔组织等等几乎所有生物大分子 (Halliwell & Gutteridge, 1999; Esterbauer et al. 1991)。氧分子的单电子还原导致了以下活性氧基团的产生：
但是，在图Ⅱ中各种主要生物组分的逐步氧化过程更值得我们去深刻认识和反思：
图Ⅱ. 一般生物大分子在被氧化过程中功能基团逐步衍变的示意图（参见pdf附件）
在图Ⅱ显示的分子基团中，羰基物质（即生物分子中含有一个碳氧双键，或者羰基基团，主要是指醛基和酮基）是一种有自发反应活性的活跃的代谢中间产物。当他们与临近的不饱和键或功能团形成共轭时，则可能造成生物分子间的交联，形成难以清除的聚集性产物，如各种各样的老年色素类生物垃圾。
大量的关于老年色素类生化物质的形成机制，反应过程和生物毒性的知识已经通过研究脂质过氧化物获得(Comporti, 1985, Halliwell & Gutteridge, 1999)。脂质过氧化物的生成始于不饱和脂肪酸的氢抽提，而氧气分子与提氢的不饱和脂肪酸反应形成脂过氧化物离子。脂过氧化物的降解生成了各种各样的衍生物(Schauenstein & Esterbauer, 1979; Esterbauer et al. 1991)，其中包括各种各样的不饱和羰基化合物，这些不饱和羰基化合物包括烯醛，二烯醛，三烯醛，4-羟基壬烯醛，二酮醛，脱氧邻醛酮和各种还原醛，他们都非常活跃，几乎对细胞内外所有的生物分子产生毒性(Esterbauer et al., 1991; Yin & Brunk, 1995; Baynes, 2000)。
许多羰基物质能在生理条件下与生物组织中重要的生化基团（例如氨基、硫基或者氢氧基）迅速反应。不饱和羰基物质的二级功能团导致了交联反应，增加了产生不可逆反应产物的可能(Bjorksten, 1968)。Napetschnig (1981) 报道4-羟基壬烯醛（HNE）可以与几乎任何氨基酸在适当的条件下反应。4-羟基壬烯醛和丙二醛与蛋白质和核酸中的氨基基团反应已经进行了多方面的研究(Wolman, 1980; Winter et al., 1986)。
由于它们的相互反应，羰基产物，特别是脂质过氧化物的a,β-不饱和羰基基团，涉及了多种细胞损害，包括：谷胱甘肽的消耗，蛋白质损变，钙离子平衡的破坏，蛋白质合成和更新的退化和DNA，RNA修复效率的下降等等(Esterbauer et al., 1991; Schaur, 2003; Eckl, 2003; Zarkovic, 2003)。
与稍纵即逝的氧自由基损伤大相径庭的是，毒性醛酮常常能穿透膜结构，并在细胞和组织中进行长距离穿行，从而几乎能达到身体的任何组织。
总之，氧化应激是外伤，羰基应激是内乱，是导致失修性分子损变的分子基础。外因是条件，内因是根据，当氧自由基如闪电般划过之后，羰-氨交联的共轭产物稳定地留在了生物大分子的每一个可能的角落。如果体内垃圾的“清道夫”（例如，与降解和修复相关的酶）没有及时出现或‘工作不力’，与衰老相关的不可逆的生物分子老化改变则会在体内累积。
六、从老年色素的研究到羰基毒化衰老学说
迄今为止，大量的生化研究表明脂质过氧化物和非酶糖基化将通过不饱和羰基化合物最终形成老年色素(Wolman, 1980; Yin, 1996; Szweda et al., 2003)。拿硫代巴比妥酸反应产物（TBARS）为例(Uchiyama et al, 1978)，它是一种最广泛应用的不饱和羰基物质存在的量化指标，一些疾病，例如，炎症，发烧，中风和手术能够引起体液高浓度的硫代巴比妥酸反应物的产生(Yagi, 1982; Kosugi et al., 1994), 甚至在一般的应激情况下也会加速这种物质的生成。例如，老年人血浆中的TBARS是年轻人的两倍(Yagi 1982)，而糖尿病人血浆中TBARS含量是正常人的1.5倍(Sato et al., 1979)。
不仅与衰老和疾病有关，不饱和羰基的含量在日常活动中，例如，剧烈运动和缺少睡眠时也会增高。在激烈运动后人尿中TBARS的含量是正常情况下的5-6倍，而失眠者的人尿中TBARS含量是正常情况下的8-10倍(Kosugi et al., 1994)。已经被实验反复证实的是每当TBARS含量变高时，羰基毒化导致的衰变将会被加速(Comporti, 1985; Esterbauer et al., 1991; Yin, 1995)。
1992 年，印大中博士发表在《衰老机理与进展》杂志的一篇文章，首次明确地指出羰-氨反应是自由基氧化和非酶糖基化两大生化副反应的共同点和兼有反应，是老年色素形成终产物的关键过程(Yin, 1992，参见图I）)。以后又进一步阐明了羰-氨反应是氧化和糖基化造成缓慢生物老化过程的不可避免，并且是大部分不可修复的核心过程。这个缓慢生物老化的本质就是羰-氨交联反应(Yin, 1995; Nilsson & Yin, 1997)。
对于4-羟基壬烯醛（HNE）毒性的大量研究，尤其是近年来国际HNE俱乐部的出色工作进一步证实了HNE对体内不同系统造成的种种毒害与衰老的相关性(Esterbauer et al., 1991; Schaur, 2003, Eckl, 2003)，这些毒性伤害从生理水平到病理水平几乎无所不在(Diazani, 2003; Zarkovic, 2003)。在尸检样本，神经退行疾病，炎症，糖尿病，动脉粥样硬化，肾变病患者等老年性疾病的病灶中，对糖基化终产物受体（AGE受体）的研究以及对糖基化终产物 (AGEs)和脂质过氧化物终产物（ALEs）的免疫探测也证实了HNE的基因毒和细胞毒性的存在(Yan et al., 2003; Yamagishi et al., 2003; Chavakis et al., 2004)。
美国国立医学科学院 Stadtman教授在对于动物和人体内蛋白质老化的研究中还观察到了另外一类重要的实验现象(Stadtman, 1992, 2003)。他们发现老年动物体内蛋白质的羰基含量大大高于年轻动物，他们估计，老龄动物体内40%～50%的蛋白质已被氧化而以含羰基的醛酮形式存在(Stadtman, 1992, 2003)。这些实验结果与脂质过氧化的结果互为印证，说明了体内的醛酮物质随龄递增的事实。无疑，蛋白质醛酮的增高也会导致自发的羰-氨交联和不可逆的老化改变的累积。这在许多老年性疾病患者的病灶或尸检样本中早已是屡见不鲜的事实。
羰基毒化所导致的蛋白质交联实际上是1968年由Bjorkstern提出的交联衰老理论的核心生化过程(Bjorksten, 1968)，其他的交联因子则相对次要得多。40年来，新的重要的交联反应至今未见报道。
根据以上所提到的数据和对于老年色素生化形成的研究，Yin和Brunk在1995年提出了羰基毒化衰老理论(Yin, 1995; Yin & Brunk, 1995)。
从某种程度来讲，研究衰老最大的困惑在于因果难分 (de Magalhaes, 2005)。Miyata等人近年来深入研究的羰基应激导致糖尿病、肾病变的许多重要发现(2000, 2003)，虽然看上去像是在研究氧化应激后的次级损伤因素，但实际上（我们认为）是涉及了导致衰老的最关键因素。在衰变的过程中，羰基毒化比氧自由基损伤更加深刻地揭示了衰老的本质，因为羰基毒化基本上直接与前面公式所提的“关键衰老过程”部分相关！
研究老化最容易犯的错误就在于混淆急性和慢性的机体变化。羰基毒化衰老学说最核心的内容在于透过现象看本质，着眼于一些最常见的生化副反应所造成的累积性的、缓慢的生化变化，并强调了清除每天制造的生物垃圾的重要性(Yin & Brunk, 1995; Terman, 2001)。
综上所述，从老年色素的形成和组成反推衰老机制，尽管得到的不是衰老生化机制的全景图（已修复更新部分无从逐一给出），但因为拥有衰老生化的主要线索和最终结果，尤其是损变与修复的净结果（老年色素的生化组成），衰老过程的概貌已基本浮出水面(Sohal,1981; Porta, 1990; Yin, 1996)。
七、衰老的起因、机制与失修性损变累积
有必要指出，衰老的起因与机理可以是两个不同的概念。就像能量是万物生长的条件和最初因子，而不是生长过程本身（参见公式1）。自由基氧化伤害无疑应该算入衰老的起始因子和加速因子（此类损变主要为非交联性一次反应）；而以不饱和醛酮与氨基交联反应为核心的累积似乎更能代表衰老的重要机理或过程。理由很简单，不饱和醛酮-氨基类反应有“二次反应”的分子结构（例如，含两个共轭的羰基），一旦清理不及时，则可进一步（第二个羰基与蛋白质等）反应，产生稳定（势能低，熵值高）的共轭交联的不可逆产物，生物体对这样的“垃圾产物”往往无酶可解，在很多组织中又弃之不得，只好“凑乎着过日子” (Yin, 1995; Terman, 2001)。
具体地讲，自由基氧化和非酶糖基化都会造成生物大分子的损变，损变的形式多种多样，有断裂、有脱氢、有氧化、有交联，尤其是疾病状态时，氧自由基造成大量的急性损伤。但是机体的修复更新也马不停蹄，时刻都在进行，包括细胞水平的细胞凋亡，亚细胞水平的溶酶体吞噬，分子水平的还原解聚（GSH还原和硫桥解联等）、蛋白质降解更新和DNA的修复（DNA修复能力约为损伤速度的几十倍）等等(Park & Gerson, 2005)。因此尽管生命组织每天“伤亡惨烈”，但由于修换及时，并不“危在旦夕”。真正修换更新不净的交联性“二次反应”才会积累，这个积累才属衰老性修饰，才是衰老性质的失修性损变。
尽管动物拥有高度完善的羰基应激防御系统，但是它们的生物分子仍然沉浸在不断产生的不饱和醛酮的包围中(Esterbauer et al., 1991; Yin, 1995; Baynes 2001)。因而，各种毒性羰基化合物所诱导的机体的逐渐生理变异就无所不在、不可避免。如果说自由基/美拉德反应的第一阶段是属于启动和加速衰老的病理性进程，那么以羰基应激为核心过程的交联积累造成的则主要是不可逆的蓄积性的生理性衰老改变。
从生化指标来看，无论是与氧化应激相关的不饱和醛酮的增加，或是蛋白质醛酮的增加，还是与糖基化相关的羧甲基赖氨酸和戊糖唏啶（pentosidine）的随龄增加，它们或者是老化前期的一个信号，或者是老化晚期的一项指标，代表着失修性损变积累的程度，代表着衰老的威胁或是衰老的进程。
简言之，损变的原因可以多样，可快、可慢；可生病、可无病。然而，失修性积累才是问题的实质，才是衰老机制（参见公式1）。
总之，损伤不是衰老机制，损伤是起因，积累才是机制，积累是损伤减去修复的剩余值（参见公式1）。脂褐素、老年斑、血管硬化、器官纤维化等都是积累，都是重要的生命老化的外在表现。“积劳成疾”才是病变，“积累成灾”才是老衰。
八、生命如何被熵增毁灭
物理化学的知识告诉我们，物质的能量活动都无一例外地服从热力学的基本规律。根据热力学第二定律：一个孤立系统中的熵一定会随时间的延长而增加，即所谓熵增原理。熵增过程是一个自发的由有序向无序发展的过程(Bortz, 1986; Roth, 1993)。
早在1947年薛定鄂就曾高瞻远瞩地指出了熵增过程也必然体现在生命体系之中(Schrodinger 1947)。人体是一个巨大的化学反应库，生命的代谢过程建立在生物化学反应的基础上。从某种角度来讲，生命的意义就在于具有抵抗自身熵增的能力，即具有熵减的能力。在人体的生命化学活动中，自发和非自发过程同时存在，相互依存，因为熵增的必然性，生命体不断地由有序走回无序，最终不可逆地走向老化死亡。几十来年，熵增衰老学说曾经多次被不同领域的科学家提起(Sacher 1967; Bortz, 1986; Roth, 1993)，但由于种种原因，又被长时间地打入冷宫。
主要的问题似乎在于：熵增衰老学说往往被讥讽忽略了“熵增原理的前提条件必须是一个封闭的能量体系”。对于生活中的每一个人，其身体都是一个开放的能量体系。微观地来看，机体中的每个细胞也都是一个个开放的能量体系(Kirkwood, 1999)，在正常状态都可以获得足够多的能量供应而获得熵减。
其实，熵增衰老学说苦苦思考和努力挣扎而企图解释的不是给生命体补充能量的问题，而是：生命体的哪些组织的哪些分子发生了哪些增龄性的熵增变化。
这个问题的解答长期以来一直让人望洋兴叹，直到今天才逐渐柳暗花明(Yin, 2003; Yin & Chen, 2005)。
这个问题的生化表述，已在本文前面的章节里得到了充分的讨论。就是生命活动中种种自发产生的生化副反应造成的失修性损变，主要包括自由基氧化、非酶糖基化、蛋白质交联等等。这里的失修性损变即为熵增的分子表现形式，例如蛋白质的共轭交联是放能过程而使生命体系熵增（参见图1），带有随机性质的交联产物无法被常规蛋白质酶降解而逐渐蓄积。
在自由基氧化、非酶糖基化这两大类最主要的与衰老相关的生化副反应的衬托下，羰基应激造成的积累性交联则似乎位于自发性无序化过程的核心位置。当日常生命活动的种种应激制造大量生化副反应产物时，氧化还原系统层层设防，免疫系统排除异己、凋亡细胞被识别吞噬，溶酶体和蛋白质小体展开积极降解、遗传因子被高效的修复，甚至包括尚未查明的休息和睡眠生化过程的种种保护作用，使得这个积累降到最低限度。积累越慢，衰老越慢；连续紧张，预支健康。失修性积累（熵增交联）一旦造成稳定的蛋白质损伤交联和变构修饰，生命体再作更新代谢则难乎其难。
九、展望：广义衰老学说
人类对于衰老原理的探索几乎已经涉及了生命科学的所有层次，但是，大多数学者对衰老的本质到底是什么反而觉得越来越困惑。其原因也许恰恰在于忽视了对一些生化基本衍变过程的认识，比如：生物体内缓慢逐渐的含有共性的生化副反应进程；日常生物垃圾的制造及对其清理的过程等（当然至今不明的睡眠生化机制难辞其咎）(Yin, 2000; Prinz, 2004)。
高等动物体免疫系统和内分泌系统细微的早期损变的积累往往会造成衰老的“滚雪球”效应，使得动物和人类的衰老进程在生命晚期出现病理性加速(Bortz, 1986; Kirkwood, 1999; Yin 2002)。
狭义的讲，交联反应例如羰基应激是生物衰老过程的主要方式之一。但是，在广义水平上，生化副反应的失修性积累则应该是衰老机理的大统一解释。在分子水平复杂的现象之中我们终于吹尽狂沙，去伪存真，认识到了衰老现象的生化本质。一些相关的保持健康和预防衰老的原理已深含其中。无论衰老过程还含有一些什么其它的重要信息，人类的抗衰老战略当从以上所阐述的减少生化副反应中得到有益的启示。
总之，尽管直接的DNA损伤和突变与种种老年性疾病息息相关，但与衰老过程中生理性的无所不在的蛋白质损变的积累相比，DNA损伤的影响则不显直接相关或者应该另当别论。因此笔者认为，它们不应该被列入高等动物生理性衰老的范畴。尽管由遗传所调控的抗应激、蛋白质更新、新陈代谢和机体稳态等基因网络系统扮演着高等动物衰老的先天性制约因子的角色，而自发进行的生化副反应导致的机体失修性改变则为环境相关因素导致衰老的主要表现形式。被氧自由基和非酶糖基化反应以及老年色素研究的最新成果所推举而出的羰基毒化理论似乎更能代表普遍和深刻的超越其它理论的衰老分子机理，这里，分子共轭交联所造成的生物体熵增的改变则似乎是对生理性衰老的最为合适的物理化学诠释。
文章的英文版请见以下附件：
The essential mechanisms of aging Irreparable
相关文章（以中文发表的较初级版本）
在2007年亚大国际会议向大会介绍世界抗衰老著名学者
——“千岁教授” Aubrey de Grey
与国内外“顶尖”衰老研究专家们“切磋武艺”
https://wap.sciencenet.cn/blog-38405-309521.html
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