翻译自Huimin Chen等Mechanisms of Quenching of Alexa Fluorophores by Natural Amino Acids. J. Am. Chem. Soc., 2010, 132 (21), pp 7244–7245

连接在蛋白质上的荧光团并且被其淬灭的现象，并没有被大家熟知也没有很好的表征。荧光光谱已经成为一项重要的工具，用以研究蛋白质构象和蛋白质-蛋白质相互作用。带有活性侧链基团的外在荧光分子共价连接到蛋白质内部的专门标记位点。荧光强度或寿命的改变反映了荧光团所处环境的改变。一些机理可以精确测量连接在同一蛋白质不同地方的荧光团受体和供体之间的距离，例如荧光能量共振转移(FRET)。

虽然标记后的蛋白质通常要进行分析，保证连接的荧光团没有影响到内部结构和功能，但是定量检测荧光强度的时候，并不考虑靶蛋白本身对连接的荧光团的影响。本文用Alexa荧光系列染料作为模型，阐明了蛋白本身可以对连在其上的荧光团产生效应。购自Invitrogen公司的Alexa荧光染料经常用来标记蛋白质，因为不会被光漂白或转换成三联体状态。它们的高量子效力适合于单分子研究，这种研究亮度是一个重要因素。在FRET技术中，Alexa 染料对488/555和488/594等经常被用来报告构象。

在荧光团和连接点之间可以加上像短饱和碳链这样的间隔，减少一些干扰作用，但是他们具有一定柔性，仍然可以使荧光团与附近的氨基酸接触。相同分子里与氨基酸接触引起荧光淬灭的确被观察到，和用这来报告构象状态的改变或分子内动力学。但特异性的淬灭机理并不清楚，往往归因于光诱导的电子转移，当两个分子有很近的范德华接触，一个分子（供体）被光激发，把它的激发状态电子传递给另一个分子（受体）。

本文，我们识别了能淬灭Alexa 染料 488 (AL488)、555 (AL555)和594 (AL594)的氨基酸。我们识别了AL488的四个淬灭剂：色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、组氨酸（His）和甲硫氨酸（Met）。在AL488淬灭中，我们得出一个静态和碰撞的组合机理。

AL488、AL555和AL594肼类的荧光激发扫描和双光子激发寿命测量都是在20种天然氨基酸存在和不存在两种情况下完成的（实验细节见Supporting Information）。我们识别了Trp作为这三种荧光团的通用淬灭剂。我们观察到Tyr、His和Met都淬灭AL488荧光团。虽然Trp和Tyr被认为可以淬灭某些荧光团，His和Met的包埋是惊人的。荧光淬灭可以被广泛分为起于动态或者静态机制。（理论背景见Supporting Information），比较四个氨基酸的Stern-Volmer荧光猝灭图（图1），我们观察到Trp和Tyr是AL488荧光团的强淬灭剂。然而His和Met是弱淬灭剂。在寿命和强度的测量之间斜率的不同表明Trp淬灭AL488有静态和动态成分（图2a），动态淬灭率是3.5×10⁹ M^-1 s^-1。AL488和Trp在溶液中预测的碰撞率，正如Smulochowski方程计算的是9.3×10⁹ M^-1 s^-1。总碰撞中导致荧光淬灭部分占0.379±0.006。这个值可能表明了，在AL488和Trp碰撞时，依赖于它们环的相对取向（立体因素）。这个与观察的Trp对噁嗪衍生物染料MR121的淬灭是通过PET介导的环环相互作用。Trp和Tyr也牵涉到在黄素蛋白质中核黄素的超快电子转移。

为了测量各种荧光对间电子转移的可行性，我们做了循环伏安法实验。我们观察到一个Trp氧化峰相对Ag/AgCl在+0.82 V和一个AL488还原峰相对Ag/AgCl在-0.68 V处。我们使用Rehm-Weller关系来确定电子转移反应的自由能。在这些数值中有一些不确定性，因为氨基酸的氧化还原过程是化学不可逆的。但是，对这个效应的一个合理评估是不超过100 mV。我们观察到电子从Trp转移到AL488是非常倾向发生的，自由能是-1.15eV。我们注意到Trp引起的总淬灭中将近半数是静态机制。我们也计算静态淬灭常数Ks是15.1 M^-1。当荧光团和淬灭剂有叠加相互作用，通常引起静态淬灭，因此形成一个非荧光复合物。这个能够解释Trp淬灭Alexa染料是不普遍的。

Tyr引起淬灭的测量被Tyr在水中的低溶解性限制。从荧光强度测量中，相对于Trp，我们观察到一个强的淬灭（图1）。来自荧光寿命和强度测量的Stern-Volmer图显示了相同的倾斜（图2b），暗示了淬灭的发生完全是动态机制。因为苯丙氨酸（Phe）不淬灭AL488荧光，我们推测荧光发生起于AL488和Tyr上的酚羟基间的PET。的确，PET过程，Tyr是一个好的电子受体。我们观察到一个还原峰相对Ag/AgCl在-0.50 V，这个过程电子从Tyr转移到AL488自由能是-1.38 eV。

我们观察到Met淬灭AL488主要通过碰撞淬灭（图2c），速率是1.67×10⁹ M^-1 s^-1。总碰撞中，引起淬灭的占0.195±0.008。Met的侧链中有一个埋到饱和碳链的硫原子易于被氧化。因此，我们期望淬灭开始于来自活性硫原子的PET。Met显示了一个一个氧化峰相对Ag/AgCl在+0.72 V。我们观察到电子从Met转移到AL488也是容易的，自由能是-1.21 eV。

His引起AL488的淬灭有静态和动态成分（图2d），动态淬灭速率是1.37×10⁹ M^-1 s^-1。总碰撞中引起吹灭的占0.14±0.01。His的咪唑基团氧化和还原反应都参与，使PET成为一个可能的碰撞淬灭机制。His有第一个氧化峰相对Ag/AgCl在-0.45 V和+0.53V。转移的自由能约-1.40 eV。与Trp相似，静态淬灭发生可能主要是His咪唑环和AL488的叠合作用。

虽然通常假定荧光团不与蛋白质中标记的氨基酸发生作用，本文中我们却发现Alexa染料488、555和594的荧光被Trp、Tyr、Met和His的残基淬灭，这种淬灭是一个静态和动态结合的机理。当荧光团与Tyr残基连接少于三个残基，我们的确观察到AL488的变光（数据没有展示）。根据这个发现，分子内淬灭的潜在效应应该考虑标记位点的选择和与荧光强度的定量测量关联的数据解释中。

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