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水稻转化方法2

已有 5049 次阅读 2008-2-14 16:18 |个人分类:生活点滴

NB基本培养基(右边的为N6,大量相同,glycine甘氨酸2 mg/L)

KNO3                               2830 mg/L

(NH4)2SO4                                      463 mg/L

KH2PO4                                         400 mg/L

MgSO4.7H2O                       185 mg/L

CaCl2.2H2O                            166 mg/L

FeSO4.7H2O                        27.8mg/L   5.6

Na2EDTA                         37. 5 mg/L   7.5

MnSO4.4H2O                        10 mg/L    27.8

H3BO3                                              3 mg/L     1.6

ZnSO4.7H2O                          2 mg/L    1.5

Na2MoO4.2H2O                    0.25 mg/L      0.25

CuSO4.5H2O                      0.025 mg/L     0.025

CoCl2.6H2O                       0.025 mg/L     0.025

KI                                0.75 mg/L     0.8

盐酸硫胺素 thiamine CHL VB1        10 mg/L     0.1

盐酸吡哆醇 pyridoxine-CHL VB6      1 mg/L       0.5

烟酸   nicotinic acid                  1 mg/L     0.5

肌醇  myo-inositol                   100 mg/L    100

水解酪蛋白                        300 mg/L

谷氨酰胺                          500 mg/L

脯氨酸                            500 mg/L

蔗糖                            30,000 mg/L

PHytagel                            2.6 mg/L

pH                                5.8

 

 

Basic培养基

B  N6(大量)    50ml  20倍)      

A  Ms-Fe      10-20ml100倍)    CH        0.3g/L

S  B5 macro       10ml  100倍)    phytogel     4g/L    agar 8g/L

I  B5 vita         10ml  100倍)    sucrose      30g/L

C  proline         0.5g/L             glutamine    0.5g/L

 

 

 

N6 (大量梗稻种子)  终浓度           母液(20)                    终浓度           母液(20)

KNO3         2830mg/L           56.6g/L       MgSO4.7H2O        185 mg/L           3.7 g/L

(NH4)2SO4      463 mg/L           9.26 g/L      CaCl2.2H2O       166 mg/L          3.32 g/L

KH2PO4        400 mg/L           8.00 g/L

制备 1  KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.

     2  MgSO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1,边倒边搅, 不能有沉淀.

     3  CaCl2.2H2O的配制同MgSO4.7H2O

     4  配好后放于棕色瓶4保存

 

MS(大量籼稻种子) 终浓度          母液(20)               终浓度       母液(20)

KNO3         1900 mg/L         38g/L    MgSO4.7H2O      370 mg/L      7.4 g/L

NH4NO3       1650 mg/L         33 g/L    CaCl2.2H2O      440 mg/L       8.8 g/L

KH2PO4       170 mg/L          3.4 g/L

制备 1  KNO3, NH4NO3, MgSO4.7H2O同时倒入烧杯,加水搅拌

     2  KH2PO4先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1,边倒边搅,

     3  CaCl2.2H2OKH2PO4

     4  配好后放于棕色瓶4保存

 

Ms(大量花药用)   终浓度        母液(20)                终浓度      母液

元素KNO3       2830mg/L        56.6g/L     MgSO4.7H2O    370 mg/L     7.4 g/L

培养(NH4)2SO4      231 mg/L        4.62 g/L    CaCl2.2H2O     160 mg/L     3.2 g/L

  KH2PO4      641 mg/L       12.82 g/L

制备 1  KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌

     2  MgSO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1,边倒边搅,

        不能有沉淀.CaCl2.2H2O的配制同MgSO4.7H2O

     3  配好后放于棕色瓶4保存

 

YM脓杆菌培养基

KH2PO4      0.5g/L        Mannitol       10g/L          L-Glutamine     2g/L     

NaCl      0.2g/L        MgSO4         0.2g/L         Yeast extract     0.3g/L       

Agar      15g/L         PH=7.0

 

诱导愈伤、继代培养基  basic+2,4-D(2mg/L) PH=5.8

 

共培养培养基

液体:N6()+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同)

     + 肌醇2g/L+ CH500mg/L+phytogel+0.1%AS

固体:N6()+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同)

     + 肌醇2g/L+ CH500mg/L+2,4-D (2mg/L)+ phytogel +0.1%AS

     PH=5.5 2,4-D前后都要调PH.灭完菌,温度降下来后加AS

 

筛选培养基  诱导愈伤+cef(300mg/L)+hyg(50mg/ml)   PH=5.5

             一筛,二筛的cef,hyg的浓度依次逐渐下降

 

分化   1: basic+KT(4mg/L)+NAA(0.25mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)

培养   2: basic+KT(0.5mg/L)+ NAA(0.25mg/L)+6-BA(2mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)

        PH=5.8

分化培养基NB培养基:6-BA,2.5mg,NAA,0.25mg,KT,0.5mg

壮苗培养基(生根)

  sucrose   30g/L      N6    25ml/L     MS-Fe    10ml/L  

  B5vita    10ml/L    agar    7g/L

 

MS-Fe(必须单独配制,否则会沉淀,用鳌合铁)

                终浓度       母液(100) 

FeSO4.7H2O      27.8mg/L       2.78g/L

Na-EDTA         37.5mg/L      3.75g/L

制备 1 FeSO4.7H2O溶解于水, Na-EDTA溶解于热水,将两者混合定容,于微波炉中加热,煮沸,

       颜色变深,冷却到室温,补水, 棕色瓶4保存

 

2,4-D母液(1g/ml)  用无水乙醇溶解2,4-D后缓慢加入到H2O,搅拌,如产生沉淀,则重配.

                 配好后4保存

NAA母液(1g/ml)  1N KOH 溶解NAA,用水稀释定容, 4保存

PAA母液(1g/ml)  用无水乙醇溶解加H2O搅拌,定容,4保存

6-BA母液(1g/ml)  HCl溶解, 加少量HCl,用玻棒研磨成糊状,再加HCl使之完全溶解

AS(乙酰丁香酮)DMSO直接溶解定容19.62mg/ml,分装到无菌小管

KT 母液(5mg/ml) 1NKOH溶解,用水稀释定容到10ml,过滤灭菌后分装到EP管中,冰冻保存

 

B5 vitamin       终浓度    母液(100)                   终浓度      母液(100)

      肌醇      100mg/L    10g/l           Nico-acid      1mg/l        0.1g/l

   pyrido(B6)     1 mg/L     0.1 g/l          thiamin(B1)   10 mg/L       1 g/l

棕色瓶4保存(每次配100ml为好), 肌醇在配培养基时,加入到培养基中

 

B5(micro)

KI   0.75mg/L  H3BO3 3.0mg/L  MnSO4 10mg/L     ZnSO4  2.0mg/L    Na2MnO4.2H2O  0.25mg/L

CuSO4  0.025mg/L  CoCl2  0.025mg/L

 

程序

1.种子去皮,挑成熟完整健康的种子

2.70%乙醇清洗浸泡2-3分钟,洗3-4次,用0.1%升汞浸泡20-40分钟

3.无菌水洗34

4.置于虑纸上吹干,3小时以上

5.摆放到诱导愈伤培养基上,黑暗中培养15-20天,直到长出黄色较大的愈伤

6.剥下愈伤,转至继代培养基上,黑暗培养2

7.共培养。脓杆菌与愈伤在液体共培养基中轻轻摇培30分钟,转至共培养基(用虑纸盖住培养基)上,

  吹风3-4小时。黑暗培养3

8.转至筛选培养基上,吹风吹干。黑暗培养2周。转至二筛培养基上,黑暗培养2周,直到长出新的愈伤。

9.转至分化培养基上,黑暗培养一周。然后明暗交替(16小时:8小时)

10.     剪苗后,转至生根壮苗培养基上

11.     移苗到温床,田间。



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