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水稻转化方法

已有 10470 次阅读 2008-2-14 16:16 |个人分类:生活点滴

水稻转化 (来自文献http://www.springerlink.com/content/nt36q44450563406/fulltext.pdf)

For rice transformation, mature rice seeds were de-husked and sterilised with 3% sodium hypochlorite (30 min). The seeds were thoroughly washed three times with sterile distilled water and transferred onto MS basal medium (Murashige and Skoog 1962) containing 500 mg/l proline, 300 mg/l casein hydrolyte, 2 mg/l 2,4-dichlorphenoxy acidic acid (2,4-D) and 30 g sucrose, for 1 week. The freshly induced calli were dipped in Agrobacterium tumefaciens (AGL1 strain) and transferred onto NB medium (N6 macro-elements, B5 micro-elements) containing 500 mg/l proline, 300 mg/l casein hydrolysate, and 30 g sucrose. After co-cultivation with Agrobacterium (no dim light, 28, 2 days), the calli were transferred onto NB medium containing 2 mg/l 2,4-D, 120 mg/l G418, and 500 mg/l Cefotaxime. The resistant calli were subcultured on fresh plates at 2-week intervals for 4 weeks, and then transferred onto MS medium containing 0.2 mg/l anaphthalene acetic acid (NAA), 3 mg/l 6-benzylaminopurine (6-BA) and 150 mg/l G418 until shoots regenerated. Shoots were transferred onto 1/2 MS medium containing 0.5 mg/l NAA for rooting and further growth. The transgenic plants were grown in the field or at 28℃ under a 16/8 h light/dark cycle in the greenhouse.
 

 

配置1诱导培养基:

1.         水解酪蛋白                        300 mg/L

2.         谷氨酰胺                          500 mg/L

3.         脯氨酸                            500 mg/L

4.         肌醇                              100 mg/L

5.         蔗糖                              30g/L

6.         PHytagel                            2.6 mg/L

N6大量50毫升,B5微量5毫升,B5维生素5毫升,铁盐毫升,2,4-D母液2毫升,pH 5.8

 

 

5.1 水稻转化受体的准备

5.1.1水稻幼胚愈伤组织的诱导培养

取开花后12-15 天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,70%乙醇浸泡1-2分钟,然后用加有几滴Tween201.25%的次氯酸钠溶液(活性氯含量为1.25%)浸泡90分钟,进行表面灭菌。(灭菌时要经常搅拌) 用无菌水冲洗3-4次,沥去水备用。在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB培养基)上,26暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织,转入新鲜配制的继代培养基(NB培养基)上,在相同条件下继代培养5天左右,用于共培养。

 

5.1.2水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养

去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟,然后用0.1%升汞浸泡30分钟,进行表面灭菌(最好在摇床上进行),无菌水冲洗3-4次,再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后,放在成熟胚愈伤诱导培养基上,26暗培养。约10-15天后,剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上,在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。挑选继代培养4-5天、色泽淡黄颗粒状的愈伤组织共培养。

成熟季节的天气;颖壳和种皮表面没有麻点 (病斑);按成熟度分开(青米优于完熟米)

        意:粳稻不适宜用NaClO灭菌。

 

5.2 农杆菌的培养

将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L KanamycinYM平板上划线,28黑暗培养2-3天,用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD6000.3-0.5,加入AS,使AS终浓度为100mΜ,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

 

5.3 水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

挑选状态较好的继代到一定时间的水稻愈伤组织放入无菌三角瓶中,然后加入适量农杆菌悬浮液(至少保证有足够的菌液与材料接触), 室温放置20min, 并不时晃动。取出愈伤组织,在无菌滤纸上吸去多余菌液, 随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上(将诱导愈伤和继代培养时始终紧贴培养基的那一面依然朝下放置,愈伤应摆放整齐,相互之间最好不要叠放),26黑暗培养2-3天。

仔细挑选无菌、状态较好(继代培养4-5天、色泽淡黄、颗粒状)的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中,加入适量农杆菌悬浮液,室温放置20min,并不时晃动。倒掉菌液,将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上,25黑暗培养2-3天。

 

5.4 抗性愈伤组织的筛选

将共培养后的愈伤组织(也可以水洗除菌后)放在含有50mg/lHygromycin的筛选培养基上,26暗培养14天,转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化,然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。

现象:愈伤组织在选择培养基上出现脓状现象,导致培养失败。减少菌量和共培养后水洗并不能消除这一现象。

对策:需要从两方面把关:从继代培养开始,精心挑选愈伤组织,杜绝染菌的愈伤组织。另一方面,严把农杆菌关:农杆菌不应该多次传代,坚持用单菌落的农杆菌划线。

 

5.5 抗性愈伤组织的分化

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中,挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L Hygromycin的分化培养基上,先暗培养3,然后转至15h/d光照条件下培养,一般经过15-25天左右,有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中,挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/l hygromycin B的分化培养基上,先暗培养3天,然后转至15h/d光照条件下培养,一般经过15-25天左右,有绿点出现,30-40天后进一步分化出小苗。

只要愈伤组织的质量符合要求,预分化并非必需。我们省略了预分化,将抗性愈伤组织直接转到分化培养基上,不但节省了能源、昂贵的hygromycin B ABA,大大降低了成本,而且使转基因的时间缩短了10天。

 

5.6 生根、壮苗和移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm,将小苗移到生根培养基上,培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗,用温水洗去培养基,在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度,如果天晴,需要遮荫到小苗成活(以吐水为准)。

A  再生的转基因苗要适时移到生根培养基上,保证转基因苗在试管中生长正常。

B  对过于细小的苗通过剪根、剪叶和再次转培,使转基因苗强壮。

C  选苗高约10-15cm,根系旺盛的试管苗,选择时机直接移栽入土。

D   平整土地,保持水位,适当遮阴。

1,试管苗根系发达,株高约10cm

2,选择天气:春夏季选阴天、傍晚移栽;

      冬季选晴天移栽,连续阴雨天不适合移栽

3,洗根时的水温要与土温基本一致

4,洗根和移栽时不要将成丛的试管苗分开

5,平整土地,控制水面,水不能淹没植株 

 

培养基

(1)       LB培养基

Trypton

10

g/L

Yeast extract

5

g/L

NaCl

10

g/L

Agar

15

g/L

pH 7.0

 

 

(2)       YM培养基

KH2PO4

0.5

g/L

Mannitol

10

g/L

L-Glutamine

2

g/L

NaCl

0.2

g/L

MgSO4

0.2

g/L

Yeast extract

0.3

g/L

Agar

15

g/L

pH 7.0

 

 

3NB基本培养基

KNO3                               2830 mg/L

(NH4)2SO4                                      463 mg/L

KH2PO4                                         400 mg/L

MgSO4.7H2O                       185 mg/L

CaCl2.2H2O                            166 mg/L

FeSO4.7H2O                        27.8mg/L

Na2EDTA                         37. 5 mg/L

MnSO4.4H2O                        10 mg/L

H3BO3                                              3 mg/L

ZnSO4.7H2O                          2 mg/L

Na2MoO4.2H2O                    0.25 mg/L

CuSO4.5H2O                      0.025 mg/L

CoCl2.6H2O                       0.025 mg/L

KI                                0.75 mg/L

盐酸硫胺素                         10 mg/L

盐酸吡哆醇                          1 mg/L

烟酸                                1 mg/L

肌醇                              100 mg/L

水解酪蛋白                        300 mg/L

谷氨酰胺                          500 mg/L

脯氨酸                            500 mg/L

蔗糖                            30,000 mg/L

PHytagel                            2.6 mg/L

pH                                5.8

 

 

(4)水稻愈伤诱导及继代培养基(粳稻)

NB

 

 

2,4-D

0.002

g/L

L-Glutamine

0.5

g/L

Proline

0.5

g/L

Casein

0.3

g/L

Sucrose

30

g/L

Gelrite

2.6

g/L

pH 5.8

 

 

5)共培养培养基

NB基本培养基(不包括谷氨酰胺和脯氨酸,加10葡萄糖/)     

2,4-D                           2 mg/L

肌醇                            2 mg/L

pH                              5.5-5.2

AS(acetosyringone,乙酰丁香酮)      100µM 10-20毫克/

注释:AS于用前溶化的培养基放至55左右时加入;

共培养液体培养基中不加2,4-D

 

6)抗性筛选培养基

NB基本培养基

2,4-D                                       2 mg/L

cefotaxine(头孢霉素)                        500 mg/L

hygromycin B(潮霉素)                        50 mg/L

pH                                        5.8

二筛时可适当降低头孢浓度。

7)水稻分化培养基(粳稻)

NB

 

 

BA

0.002

g/L

NAA

0.0005

g/L

Sucrose

30

g/L

Gelrite

3.5-2.6

g/L

pH5.8

还要加头孢300毫克/ 潮霉素50毫克/升,增加培养基的硬度和渗透压,山犁醇30/

 

 

(8)水稻长根壮苗培养基(粳稻)

1/2 NB 无机盐

 

 

1/2 B5 有机

 

 

Sucrose

10-15

g/L

Gelrite

2.6

g/L

pH 5.8

 

 

(9) 20×N6大量元素母液

KNO3

56.6

g /L

(NH4)2SO4

9.26

g /L

KH2PO4

8

g /L

MgSO4. 7 H2O

3.7

g /L

CaCl2.2H2O

3.32

g /L

10 100×B5 有机母液

Inositol (肌醇)

 10

g/L

Nicotinic AcidVB5

100

mg/L

PyridoxineVB6

100

mg/L

ThiamineVB1

1

g/L

注意:棕色瓶4度保存,每次配100毫升为好,肌醇在配培养基时直接加到培养基中。

11100×B5微量元素母液

H3BO3

300

mg/L

MnSO4.H2O

1000

mg/L

CoCl2.6H2O

2.5

mg/L

CuSO4.5H2O

2.5

mg/L

ZnSO4.7H2O

200

mg/L

Na2MoO4.H2O

25

mg/L

KI

75

mg/L

12100×MS  Fe盐溶液

FeSO47H2O

2.78

g/L

Na2EDTA

3.75

g/L

(13)20×MS大量元素母液

MSMgSO4.7H2O

3.7

g/L

KH2PO4

1.7

g/L

KNO3

19

g/L

NH4NO3

16.5

g/L

CaCl2.2H2O

4.4

g/L

(14)100×MS微量元素母液

H3BO3

0.62

g/L

MnSO4.4H2O

1.56

g/L

CoCl2.6H2O

0.0025

g/L

CuSO4.5H2O

0.0025

g/L

ZnSO4.7H2O

0.86

g/L

NaMoO4.H2O

0.025

g/L

KI

0..83

g/L

(15) 100×MS有机元素母液

Myoinositol

 10

g/L

Nicotinic AcidVB5

0.05

g/L

PyridoxineVB6

0.05

g/L

ThiamineVB1

0.1

g/L

 

培养基和激素母液配制方法

1100×MS Fe盐溶液

 称取2.78g FeSO47H2O溶于水(A液);

 称取3.75 g Na2EDTA溶于热水(B液);

 混合AB液,加水接近1000ml

 把混合液置于微波炉内加热煮沸,混合液颜色变深,冷却到室温;

 定容到1后置于棕色试剂瓶内4保存。

 

 

 

 

 

 

 

 

20.5mg/ml 2,4-D母液的配法

 称取100mg 2,4-D,置于小烧杯内;

 加少量无水乙醇使之完全溶解;

 2,4-D酒精溶液缓缓加入磁力搅拌器上的水中,如果出现沉淀,需要重新配置;

 定容至200ml4保存。

 

30.5mg/ml α-NAA母液的配法

 称取100mgNAA置于小烧杯内;

 1NKOH溶液溶解NAA

 用水定容至200ml4保存。

 

40.5mg/ml 6-BA母液的配法

 称取100mg 6-BA置于小烧杯中;

 加少量的浓盐酸,用玻棒研磨成糊状,再加入少量浓盐酸,使之完全溶解;

 用水稀释并定容至200ml4保存。

 

5100mM乙酰丁香酮(As)的配制

称取196.2mg As,用5ml DMSO直接溶解,并定容至10ml,分装入无菌的小管,

-20冰冻保存。

 

6 5mg/ml KT的配法

称取100mg kenetin,用少量1N KOH溶解,用水稀释定容至20ml。过滤灭菌后,分装入无菌小管中,-20冰冻保存。

 



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