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IP: 159.226.89.*   [4]魏雪苹   2012-8-3 00:46
感谢您的耐心回复,再有问题的时候再来请教!谢谢您!
IP: 159.226.89.*   [3]魏雪苹   2012-7-27 19:44
您好!读了您的文章,对HRM方法很感兴趣,有些具体的实验问题想请教您:1.HRM方法对引物有什么要求吗?还是和普通用于测序的引物同样的设计方法呢?2. RealTime PCR的每一个样品要做三个重复吗?3.是不是也需要内参呢?按照该方法的原理可以检测到一个位点的变异,实际实验过程中往往有误差,多少比例的差异才可以用HRM的方法呢?希望得到您的指点,谢谢您!
我的回复(2012-7-28 19:38):您好!逐条回答一下:1.对引物没有要求,只要扩增出来的产物不要太大(目前经验认为在350bp以内较好,但也不一定);另外,有时候的引物需要的PCR热循环程序比较特殊,这时候要注意你的realtime PCR仪器是否支持这样的程序;2.为了保证实验的准确性,三个重复是需要的,如果实验操作很熟练了,两个重复也可以;3.。我们仅仅为了检验批次之间的数据能否互相比较,所以用了外参,但没用内参。如果你们使用内参,也是可以的,要注意模板用量,用好了甚至可能得到更高的灵敏度(我们准备在下一篇文章里讨论这个可能)。4. 差异不存在“比例”一说,差别大的也可能检不出,差别小的也可能检得出,机制很复杂,但可以用umelt来做预测。
IP: 159.226.89.*   [2]liunian607   2012-7-20 15:59
谢谢您的指点。另外您文中提到各个变异位点的变异信息,这些变异信息可以通过HRM即可得知,还是已有序列数据信息呢
我的回复(2012-7-30 22:19):不客气~ HRM只能确认是否存在变异。要确定具体的DNA序列信息,还是要靠测序。(上次回复错了地方,希望你看见了。)
IP: 159.226.89.*   [1]liunian607   2012-7-19 11:13
你好,我是植物所的学生,最近阅读了您的文章,对HRM方法在居群生物学上的应用很感兴趣,但对相关的背景知识不是很清楚。想请教下HRM对RT-PCR仪器有什么要求吗
我的回复(2012-7-19 17:06):你好!
HRM一个是要求仪器不能太旧,我想这不是个问题,Roche公司的LightCycler480以上的机型都可以做,但LightCycler2.0的分辨率就太低了。Qiagen的Rotor gene 系列也可以,只有最老的几款达不到要求。ABI我不太熟,但只要是号称能做HRM的都没有问题。
第二个就是要求有所谓的Saturating dye,意思就是比传统的SYBR green能更充分地结合DNA 双链,因此也就能探测到更多地方的突变。这个也不是问题,各大公司都推出了自己的HRM试剂盒,内含他们自己研制的Saturating dyes。当然,如果你愿意,可以用普通PCR试剂,添加他们单独出售的Saturating dye,自己通过试验来看效果如何。(注意要弄清每种Dye要求的激发波长与探测波长,一般都和多种仪器兼容,但是可能需要自己设置一下。)

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