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High Resolution Melting (HRM) analysis 在谱系地理学中的应用

已有 5948 次阅读 2012-7-12 17:14 |系统分类:论文交流| 亲缘地理学, HRM

本人第一篇以第一作者发表的学术论文,刚刚公布于Molecular Ecology Resources的预览版上,谈的是 High Resolution Melting (HRM) analysis 这一工具可以在谱系地理学(phylogeography,或译作亲缘地理学/系统发生生物地理学)研究中用于检测未知的单倍型(haplotype)。(9月12日注:正式版已经发布在9月刊出的 Volume 12,Issue 5,pages 894-908页。)

所谓 High Resolution Melting (HRM) analysis,就是改进了的DNA熔解曲线分析。其原理就是DNA双链在加热过程中的解旋(熔解)动态与该DNA片段本身的长短及序列组成有关系。在实时(real-time)PCR 实验中,特异结合在DNA双链部分的荧光分子能够将这一解旋过程反映在最终的熔解曲线上,横坐标是温度,纵坐标是荧光强度(对应DNA双链部分的多少)。同一基因位点的两个不同等位基因,其序列差异往往会导致其熔解曲线的形状也有区别。这样,对于某段基因,虽然我们事先可能不知道两个生物个体之间是否存在变异,但通过实时PCR之后的熔解曲线测定,就能知道它们俩是否相同。同理,我们可以用它来检测每个种群内存在几种不同的等位基因(或单倍型)。目前为止还没有用于二倍体的核基因组,因为技术不够成熟。

在一个研究实例中,我们检测了石竹科的两个近缘种Arenaria ciliataA. norvegica 在欧洲的一些种群,证实了这一方法能够在大批量DNA测序之前就确定出每个种群有几种单倍型。本方法的用处在于,仅需在HRM分析之后对部分样品测序,而不需对所有样品测序,就能知道所有样品的单倍型。当然,这种方法仍然是粗线条的,存在一定的漏检率,部分变异可能无法被熔解曲线反映出来。我们最后做了一点软件模拟实验,就是为了估计漏检率能有多少。唯一保险的做法是对所有样品进行测序,但相比而言,我们的方法能节省时间和金钱。而与传统的RFLP等方法相比,我们的方法能检测到更全面的遗传多态性信息,充分利用所有采集到的样品。

其实HRM这个技术早已经不是新鲜事物,在生物医学检测领域早已经用得很普遍了。我们只不过是把它搬过来用于另外一个领域而已。唯一的改进是把它用于更长的DNA片段。有些技术不新,不妙,也不保证完全准确,但是它们在实践中被证明很有用。这就是我们这篇文章的用意。各位做谱系地理学的同行,如果有条件使用 real-time PCR 仪器的,可以考虑尝试一下我们介绍的方法。论文摘要见下面的连接。

Rapid identification of chloroplast haplotypes using High Resolution Melting analysis
DOI: 10.1111/j.1755-0998.2012.03164.x

另外推荐一个在线工具uMeltSM,可以用来预测任意一段DNA序列的熔解曲线。开发这一工具的作者是 Zachary Dwight,其所在的研究组就是当初发明快速 real-time PCR 以及HRM 分析技术的 Carl T. Wittwer 在犹他大学的实验室。他们自己也仍然在做实时定量PCR仪器的开发与设计。


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