微生物天然产物农药具有良好的生物活性与环境相容性，在植物病虫害绿色防控领域发挥着重要作用。链霉菌是微生物天然产物农药的重要生产菌之一。我国是链霉菌源天然产物农药发酵大国，积累丰富的天然产物农药菌种资源。然而，由于缺乏具有自主知识产权的农药高产菌种和关键高效生物制造技术，菌种效价低仍是制约我国天然产物农药发酵工业的重要瓶颈。

米尔贝霉素是一种广谱、高效、环境友好、人畜安全的绿色生物杀虫剂，可用于防治对有机磷农药和阿维菌素产生抗性的螨，粉虱和蚜虫等多种农业害虫。冰城链霉菌是本团队具有自主知识产权的优良米尔贝霉素生产菌，其基因组大小为11.7 Mb，是目前已测序链霉菌中最大的基因组，编码可预测调控蛋白的基因数接近600个，调控网络十分复杂。由于链霉菌次级代谢产物生物合成受到复杂调控网络的严谨控制，因此，鉴定影响米尔贝霉素生物合成的新颖转录调控子，解析其影响产物合成的调控网络，从而挖掘有效的高产靶点，对于构建高效米尔贝霉素生产菌，提高发酵效价，并加快米尔贝霉素类农药的创制和应用具有重要意义。

该工作基于分析冰城链霉菌野生型菌株BC-101-4时序转录组数据，发现四组分系统sbrH1/H2/K/R (sbrH1-R)具有与米尔贝霉素生物合成基因簇相似的表达谱，且该系统中sbrH1和sbrH2表达丰度在所有基因组注释的基因中是最高的，推测sbrH1-R可能在米尔贝霉素产生过程中发挥一定作用。为验证其功能，通过无痕缺失sbrH1-R编码框获得突变株∆sbrH1-R；平板表型分析显示，与出发菌BC-101-4比较，∆sbrH1-R失去产孢能力，并且气生菌丝生长变弱；发酵结果表明∆sbrH1-R生物量积累减弱，但米尔贝霉素产量大幅提升（从1515.3 mg/L到3136.7 mg/L），为出发菌株BC-101-4产量的2.1倍；将sbrH1-R回补后，菌株表型基本恢复到野生型状态。这些结果表明SbrH1-R是冰城链霉菌的全局性调控子，正调控冰城链霉菌发育分化和细胞生长，负调控米尔贝霉素生物合成。

∆sbrH1-R是一株生长弱但米尔贝霉素产量显著提高的菌株，为探究高产的原因，他们将∆sbrH1-R和出发菌BC-101-4进行了转录组数据分析。结果表明不仅米尔贝霉素生物合成基因簇内多个基因(milE、milA4、orf1，milF和 milD)表现出显著上调，一系列与米尔贝霉素合成所需前体（乙酰CoA、丙酰CoA，丙二酸单酰CoA和甲基丙二酸单酰CoA）合成有关的反应步骤和代谢通路基因表达水平显著上调，而负责消耗乙酰CoA进入三羧酸循环的柠檬酸合酶编码基因则显著下调（图4），推测更加有利于前体的合成和积累。代谢物检测结果证实这四种前体的胞内浓度在整个发酵产素期都显著高于出发菌BC-101-4。这些结果表明∆sbrH1-R中充足的前体供给保证了米尔贝霉素的大量合成。

米尔贝霉素合成所需前体均来自初级代谢，为验证上述主要代谢途径的显著改变是否能够真正影响米尔贝霉素的产生，构建了对应代谢通路模块包括强化丙酮酸代谢、强化脂肪酸β氧化和分支链氨基酸降解、强化苯丙氨酸降解，弱化三羧酸循环第一步反应。发酵结果表明这四个代谢途径模块均能够不同程度提高米尔贝霉素产量。

研究过程中他们还发现∆sbrH1-R分泌到胞外的米尔贝霉素量显著提高，而回补菌株CsbrH1-R的胞外米尔贝霉素含量则恢复到BC-101-4水平，这表明全局性调控子SbrH1-R能够通过影响米尔贝霉素外排转运蛋白系统表达水平而影响米尔贝霉素产量。紧接着，他们从组学数据中发现8对在∆sbrH1-R中表达水平显著上调的药物外排泵编码基因。其中sbi_00839/840是已经报道的米尔贝霉素外排泵基因。通过遗传学验证，又发现一个新的米尔贝霉素外排泵sbi_01690/1691 (MilEX2)，其过表达显著促进米尔贝霉素外排，并且也促进米尔贝霉素总产量的提高。

以上结果表明，四组分系统SbrH1-R是冰城链霉菌的全局性调控因子，通过控制米尔贝霉素生物合成基因簇，前体供给以及产物外排相关基因的表达而影响米尔贝霉素的产生。研究中鉴定得到的与前体供给和产物外排相关有效靶点，为米尔贝霉素高产菌构建提供重要参考。本研究是基于全局性调控因子通过扰动细胞代谢和生理过程而综合影响米尔贝霉素产量的理念，进行的高产靶点挖掘工作，不仅将打开全局性调控子研究的新局面，也为链霉菌高产菌构建提供普适性的新靶点发掘思路。

Transcriptome-guided identification of a four-component system, SbrH1-R, that modulates milbemycin biosynthesis by influencing gene cluster expression, precursor supply, and antibiotic efflux

Lan Ye，Yanyan Zhang，Shanshan Li，Hairong He，Guomin Ai，Xiangjing Wang，Wensheng Xiang

第一作者：

叶岚：中国农业科学院植物保护研究所与东北农业大学联合培养博士生

张艳艳：中国农业科学院植物保护研究所副研究员

通讯作者：

向文胜教授、张艳艳副研究员

该研究得到了国家自然科学基金和中国农业科学院创新工程项目支持。