代谢学人—— Cell metabolism 综述：单细胞解析脂肪组织可塑性

撰文 | 马莹 仲银召 闪光余 张俊 郭明伟

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张俊

摘要

脂肪组织具有显著的可塑性，即在生理或病理条件下具有改变细胞大小和组成的能力。单细胞转录组学的出现迅速改变了我们对脂肪组织中多种细胞类型和细胞状态的认知，并对某个细胞类型的转录变化如何影响组织可塑性提供了全新见解。在本篇综述中，作者全面的概述了脂肪组织的细胞图谱，并主要聚焦于小鼠和人类脂肪组织的单细胞、单细胞核的转录组中获得的新的理论成果。作者还认为能够通过单细胞技术观察细胞间的转化和对话。

背景介绍

脂肪组织是具有大量脂肪细胞的疏松结缔组织。这些特化细胞通过胞质中的脂滴来储存代谢能量，同时通过其内分泌功能来调节机体生理状态。哺乳动物体内的脂肪组织可根据其主要功能而分为两大类：白色和棕色脂肪组织。白色脂肪组织（White adipose tissue，WAT）是长期储存能量的主要部位，其特征是存在大型单室脂滴，在合成代谢条件下以甘油三酯（Triacylglycerides，TAG）的形式储存多余的代谢能量，并在分解代谢条件下以游离脂肪酸（Free fatty acids，FFA）的形式为外周组织提供能量。WAT分布于哺乳动物全身，主要分为皮下和腹腔内（腹膜内，与内脏相连）两类。此外，在其他部位也发现了多个较小的WAT，包括骨髓、真皮下、血管周围、心外膜以及肌肉周围和肌肉内部。除了能量储存功能外，WAT还具有许多非代谢功能，包括隔热以及支持器官的缓冲作用。

哺乳动物的第二大类脂肪组织是棕色脂肪组织（Brown adipose tissue，BAT），其在产热中起主要作用，存在于几个不同的解剖学位置，主要包括小鼠和人类的颈前、锁骨上、肩胛内、肾周和血管周围。棕色脂肪细胞的特征是多室脂滴、丰富的线粒体和解偶联蛋白1（UCP1）的表达，而UCP1则在线粒体内膜中充当质子载体。UCP1和其他无效能量循环（Futile energy cycling）的存在使得棕色脂肪细胞可以燃烧多余能量，从而以热量的形式散发或起到代谢缓冲池的作用。在成年人中，BAT最多占总脂肪组织的1%-2%，然而，在小型冬眠哺乳动物或新生儿体内，BAT的含量可占其总体重的5%。

脂肪组织与其他大多数组织的区别在于其在生理和病理条件下可以改变大小、细胞组成和功能，进而适应环境或各种应激状态。然而，这种适应性还涉及组织中细胞组成的长期性量变和质变。基质血管组分（Stromal vascular fraction，SVF）是脂肪组织中的非脂肪细胞，它由各种免疫细胞、间充质基质细胞、内皮细胞和神经细胞等高度异质性的细胞亚群组成。单细胞转录组学的迅速发展改变了人们对脂肪组织中细胞类型和细胞状态的认知，并揭示了不同细胞类型是如何影响WAT和BAT的功能。在本篇综述中，作者描述了脂肪组织的可塑性以及其对人类健康的重要性，并且对现有描述小鼠和人类脂肪组织细胞异质性的文献进行全面回顾，进而强调了从单细胞转录组学中获得的生物学见解，并讨论利用单细胞技术来探究脂肪组织可塑性的可能调节机制。

脂肪组织的短期代谢可塑性

脂肪细胞能感知并迅速适应身体代谢需求的急剧变化。关于脂肪细胞的功能发生短期性变化，一个典型例子是它在进食和禁食周期中发生的适应性变化。在进食后吸收营养的阶段时，胰岛素作为主要的合成代谢激素，促进葡萄糖和脂肪酸的摄取以及脂肪从头生成和甘油三酯合成。此外，胰岛素通过激活磷酸二酯酶3B（PDE-3B）来抑制脂肪细胞脂解，从而降低cAMP水平（小编注：在白色脂肪组织中，cAMP-PKA信号通路通过活化脂肪酶HSL，进而促进脂解，并通过抑制糖原合成酶活性，进而抑制糖原合成）。因此，胰岛素敏感性对脂肪细胞的储存能力和功能至关重要。成熟脂肪细胞中缺失胰岛素受体的小鼠表现出WAT萎缩和异位脂质沉积（Ectopic lipid deposition）。在禁食状态下，当循环胰岛素水平下降时，脂肪分解的抑制减轻。此外，交感神经系统释放去甲肾上腺素激活β-肾上腺素能受体，从而增加PKA活性，刺激脂肪细胞的脂肪分解。脂肪组织中脂肪生成和分解信号之间的平衡对于营养物质摄取和消耗的缓冲，以及维持全身代谢稳态等至关重要。

短期代谢可塑性的另一个经典例子是BAT在急性冷暴露下的激活。具体而言，交感神经系统释放的去甲肾上腺素激活β-肾上腺素能受体，进而激活cAMP/PKA轴，并诱导棕色脂肪细胞的脂解。脂肪分解释放的脂肪酸同时为线粒体β氧化提供燃料，并激活UCP1介导的产热作用。此外，PKA激活基因程序的转录，进一步维持棕色脂肪细胞中持续的分解代谢和线粒体解偶联。最近的研究表明，过氧化物酶体增殖物激活受体γ （PPARγ）以及其他转录因子的转录激活效应高度依赖于脂肪分解。因此，在棕色脂肪细胞的产热激活过程中，代谢和转录密切相关。

脂肪组织的细胞和组成的长期可塑性

脂肪组织的“棕色化”和“白色化”

长期暴露于环境和生理性应激源可引起脂肪组织中细胞组成的持续变化并调节组织内细胞编程。一个经典例子是脂肪组织适应于环境温度的变化。为了应对低温，许多哺乳动物的WAT可以表现出BAT样表型，出现产热的棕色样脂肪细胞，通常被称为“米色”脂肪细胞（“beige”or“BRITE adipocytes”）。WAT的棕色化可体现在处于休眠的米色脂肪细胞（即具有单室脂滴的脂肪细胞）的再激活，或通过白色脂肪细胞的转分化，也可以通过在脂肪干细胞从头分化为米色脂肪细胞。在啮齿类动物中，低温会导致皮下iWAT（inguinal WAT）发生显著的棕色化，而长期冷暴露同时会导致米色脂肪细胞积累在其他WAT中。此外，在进行热量限制、间歇性禁食、胃旁路手术和罹患恶病质后，可以在啮齿动物中观察到WAT棕色化。WAT棕色化与人类的关系尚不清楚，然而在交感神经活动增加的情况下，如严重烧伤、罹患产生儿茶酚胺的肿瘤，以及响应恶病质的情况下，在人类WAT中观察到米色脂肪细胞的积累。冷诱导的WAT棕色化主要由交感神经元释放的去甲肾上腺素驱动，然而也有其他一些诱因被报道。儿茶酚胺可以直接作用于脂肪细胞，激活产热基因程序，或作用于脂肪干细胞，驱动米色脂肪形成。然而，这种反应能够被局部基质细胞、适应性和固有免疫系统细胞大大增强。

值得注意的是，棕色和米色脂肪细胞依赖于持续的β-肾上腺素来维持其功能。BAT的去神经支配（Denervation）会导致其产热能力和氧化能力丧失，并伴随着脂肪组织白色化，其特征为出现白色样单房脂肪细胞。BAT的这种白色化随衰老、肥胖和向温暖环境温度转变自然发生，由干扰β-肾上腺素能信号传导的抑制信号所促进。此外，在停止冷暴露或暴露于其他热刺激后，WAT的棕色化发生逆转。当小鼠从低温环境转移到温暖环境时，米色脂肪细胞缓慢地恢复到单室白色脂肪细胞状态，具有白色脂肪细胞的大部分分子特征。然而，这些“休眠”的米色脂肪细胞保留了其先前冷暴露的表观遗传记忆，允许它们再次暴露于寒冷环境后迅速重新激活其米色表型。

妊娠和哺乳期脂肪组织向乳腺的转变

乳房脂肪组织对妊娠的反应是脂肪组织可塑性的另一显著例子。在啮齿类动物中，乳腺主要位于iWAT，在怀孕期间，该组织经历了重大转变，为哺乳做准备。储存脂质的脂肪细胞随着乳腺上皮细胞的快速扩张而基本消失。这期间，脂肪细胞发生去脂化，谱系追踪表明脂肪细胞经历去分化到前体脂肪细胞样状态。随着乳腺导管在哺乳期结束时消失，小脂肪细胞吸收母乳脂质而肥大，同时去分化形成的前体脂肪细胞重新分化。

与肥胖相关的脂肪组织重量变化

WAT体积的扩张和收缩能力在成年期极强。长期处于正能量平衡状态（能量摄入大于消耗）会导致大多数脂肪组织显著增大。WAT扩张是由脂肪细胞肥大（Hypertrophy）和脂肪细胞增生（Hyperplasia）共同驱动的。成熟的脂肪细胞不进行细胞分裂，因此脂肪细胞增生是由前体脂肪细胞（APC）分化（de novo adipocyte differentiation, 也称为 ‘‘adipogenesis’’）介导的。在身体质量指数（BMI）范围正常的人群中，WAT分别约占男性和女性体重的20%和30%。在肥胖个体中，由于皮下和腹腔内脂肪组织的扩张，其体脂率可上升至50%。肥胖发展过程中脂肪组织的扩张与其细胞组成的重大变化有关，称为“组织重塑”。这一过程包括血管扩张、细胞外基质（ECM）重塑、单核细胞的募集和促炎巨噬细胞的激活，以及间充质干细胞表型的变化。

相反，在负能量平衡期间，由于脂肪细胞缩小和消亡，一些脂肪组织在质量上收缩。虽然尚不清楚减肥过程中脂肪组织的重塑，然而在人类和啮齿动物的急性减重的早期阶段，在WAT中观察到免疫细胞浸润的增加。另一方面，两种减重手段（小鼠中的极低热量饮食模型和人类中的减重手术）已被报道与减少冠状结构（Crown-like structures，CLSs）和改善全身代谢有关。然而，在小鼠和人类的研究中发现，在长期减重过程中，WAT存在持续的低度炎症和代谢缺陷，这表明尽管全身代谢得到改善，但组织中仍存在肥胖记忆，但是尚不清楚肥胖记忆的机制和功能以及它如何影响体重反弹。

人类疾病中的脂肪组织功能障碍

脂肪营养不良（Lipodystrophy）是一种多代谢紊乱疾病，特征是缺乏形成功能性脂肪组织的能力，它突出了脂肪组织在人类健康中的重要性。在形成原因上，可能是驱动脂肪细胞分化和脂质储存的基因发生遗传突变，也可能是继发于其他条件或药物作用的结果。缺乏功能性脂肪组织会导致有害脂质积累在外周组织器官，包括肝脏、骨骼肌、心脏和内分泌胰腺，进一步导致胰岛素抵抗和心血管疾病。

另一方面，BMI升高会显著增加罹患各种严重疾病的风险，包括2型糖尿病、心血管疾病、脂肪肝和癌症。但是，一些肥胖患者至少在一段时间内可以避免出现许多代谢综合征的特征。这种被称为“代谢健康性肥胖”的发现强调了一个概念，即除了高BMI本身，其他因素也会导致代谢综合征。对病理性肥胖（Pathologic obesity，特征为肥胖和胰岛素抵抗）个体的比较表明，体脂分布在疾病易感性中起重要作用。心血管代谢合并症（Cardiometabolic comorbidities）的发生率和严重程度主要与内脏和腹部皮下WAT的扩张有关，而股骨和臀部脂肪组织似乎具有保护作用。全基因组关联研究（Genome-wide association studies，GWASs）发现，与体脂分布和健康肥胖相关的基因在脂肪细胞中高度富集，表明脂肪细胞的内在特性及其维持功能的能力在决定体脂分布和心血管代谢疾病中起着重要作用。

此外，在营养过剩的情况下，机体WAT的扩张和重塑方式会影响整体代谢健康。病理性肥胖与脂肪细胞肥大、ECM过度积累（纤维化）、促炎免疫细胞的积累、保护性脂肪因子（如脂联素）的表达下降有关。巨噬细胞浸润和促炎巨噬细胞极化会导致脂肪组织功能障碍，并可能加重心血管代谢紊乱。相反，健康脂肪组织的扩张在很大程度上与脂肪细胞增殖有关，这表明新生脂肪生成增加，以及炎症和纤维化减弱。事实上，纤维化已成为区分人类代谢健康与病理性肥胖的关键因素。因此，脂肪营养不良和病理性肥胖具有许多相同的代谢病理特征，表明脂肪细胞功能紊乱和储存能力有限在这些疾病的发展中起主要作用。

总之，维持具有高度储存能力的健康功能性脂肪细胞对人类健康至关重要，因此需要了解在人体不同脂肪中脂肪细胞的调节功能。尽管脂肪细胞的内在特性已被证明是脂肪组织整体功能的主要决定因素，但组织微环境中的各种细胞，包括免疫细胞、内皮细胞、神经细胞等，都在调控脂肪组织可塑性和脂肪细胞功能方面发挥着关键作用。因此，了解与脂肪组织功能相关的人类疾病就必须要深入研究脂肪细胞在其组织微环境中的分子特性，以及它们如何与其他类型的细胞相互作用。

脂肪结构和功能的传统研究方法

纵观脂肪研究历史，生物成像（bioimaging）、细胞培养、流式细胞术和小鼠遗传学等经典技术促进了脂肪组织的研究（图1）。近一个世纪以来，人们通过各种显微镜对脂肪组织形态和细胞结构进行了一定程度的解析，包括脂肪细胞的肥大和脂肪前体细胞的血管周围定位，以及棕色脂肪细胞中冷诱导的脂滴变化和线粒体重塑。这些开创性的组织学发现为我们研究脂肪细胞分化和脂肪组织可塑性奠定了基础。Martin Rodbell在1964年发明出脂肪细胞分离方法，这一发现极大促进了脂肪细胞代谢的分离研究，并使单独提取基质血管组分（SVF）进行研究成为可能。在20世纪70年代，随之衍生的克隆成脂纤维细胞系（如3T3-L1）是快速了解脂肪细胞功能特性和脂肪细胞分化的分子基础的关键。这些永生化细胞系帮助人们发现了脂肪细胞代谢途径和谱系选择基因（Lineage selective genes），以及调控脂肪细胞分化和功能的转录调控因子，包括主调控因子PPARγ和CCATT增强子结合蛋白α（C/EBPα）。此外，随着二代测序（Next-generation sequencing，NGS）技术的出现，永生化细胞在驱动谱系决定和分化的转录调控网络和表观遗传机制的发现上，以及脂肪细胞棕色化研究上具有重要意义。重要的是，尽管众多研究中的成脂过程是在体外进行的，但许多已确定的基本机制和转录因子也被证明在体内脂肪形成中发挥作用。

在组织水平上，转录组、蛋白质组和代谢组的高通量分析为脂肪组织的分子组成提供了全面的解析。生物化学方法常被用于定位（如免疫组织化学）和分离（如流式细胞术）不同细胞类型，而遗传学方法（Cre-loxP）则常被用于操纵或标记特定的细胞类型。总的来说，每种方法都有其独特的优势，它们仍然是脂肪研究的必要方法。然而，脂肪组织中的细胞异质性也凸显了这些方法的局限性（图1）。例如，免疫组织化学和流式细胞术必须依赖于区分细胞亚群的抗原和特异性抗体。其中，脂肪组织中的主要细胞类型（如造血干细胞、内皮细胞和间充质干细胞）虽然很容易被区分出来，但是如果想要进一步分类，则依赖于既往得到的关于其中包含的潜在细胞亚群的认识，并确定适当的成像/分选策略。此外，目前主要的小鼠基因靶向方法是Cre-loxP重组系统，而Cre重组酶的表达依赖于各种细胞中选择性激活的增强子和启动子，如脂联素增强子和启动子（成熟脂肪细胞）、Ucp1增强子和启动子（产热棕色/米色脂肪细胞），Pdgfra或Pdgfrb增强子和启动子（含有脂肪祖细胞的大量间充质细胞）。这种Cre-loxP系统的局限性在于它们针对的是广泛的脂肪细胞或基质细胞。因此，针对脂肪组织的经典研究方法对于组织/细胞异质性和可塑性的研究具有显著的局限性。

图 1.脂肪组织的经典研究技术。显微镜、流式细胞术分析、遗传谱系追踪、体外细胞培养模型和全组织组学（基因组学/蛋白质组学/代谢组学/脂质组学）是脂肪组织的经典研究工具，这些技术和工具帮助我们理解脂肪组织地组织学结构、细胞组成和功能。

单细胞技术：解析脂肪组织功能和异质性的强大工具

基于NGS的单细胞技术的出现使得人们能够在单细胞分辨率下对组织进行基因组和转录组分析，从而解放了脂肪生物学家的“双手”。这种方法的强大解析能力能够在大批量分析细胞时提供全新的生物学见解。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术已被证明是非常强大的。单细胞分辨率下的转录组学可以揭示同一细胞亚群中的不同细胞状态，而在其他方法下，这些细胞表现出均一性。阐明动态过程中的各种细胞状态可以重建细胞亚群的生物功能，并发现驱动发育过程的全新谱系层次（Lineage hierarchies），例如分化事件（图2）。因此，单细胞技术颠覆了传统细胞身份和可塑性的概念。

由于分离的脂肪细胞的浮力和易碎特性，单细胞技术的使用变得十分复杂。许多脂肪细胞相对较大（在人类中高达300微米），因此不适用于传统的基于液滴的单细胞平台，其中细胞大小受微流控通道（Microfluidic channels）宽度的限制（如来自10x Genomics的铬平台为50-60微米）。此外，由于脂质含量高，脂肪细胞在离心后会漂浮，而不像组织中的其他细胞那样沉淀。最后，即使使用不涉及基于液滴测序的策略，高脂含量也可能干扰酶促反应。总之，这些挑战使得脂肪组织单细胞分析最初仅限于非实质细胞类型。最近，基于单细胞核测序（snRNA-seq）方法的开发使脂肪细胞也能进行单细胞分析。snRNA-seq是基于从组织/细胞亚群中分离细胞核，然后对单个细胞核的RNA进行测序（图2）。然而该技术也存在一定局限性，即细胞核内成熟的RNA转录本数量较少，并且该方法难以判断由于不同RNA加工方式形成的转录本变化。然而，最近一些比较体外分化脂肪细胞的snRNA-seq和scRNA-seq的研究发现两者总体上具有良好的一致性。与scRNA-seq相比，snRNA-seq的主要优点如下：（1）不需要组织解离来将单个细胞从其原生组织环境中释放出来，而这一释放过程可能导致细胞类型出现偏差，并在转录组水平上形成解离诱导的伪像（Dissociation-induced artifacts）。（2）可以从冷冻组织中分离出高质量的细胞核，从而避免了对新鲜分离组织进行处理的需要。然而，snRNA-seq的一个主要缺点是它对来自细胞核或细胞质破裂的转录物污染（也称环境RNA）高度敏感。因此，snRNA-seq研究需要高质量的核制备和仔细的计算分析，以确保只包括高质量的液滴，并在聚类之前去除高丰度的环境转录本。

除了高通量单细胞转录组学技术外，科研人员还开发了大量单细胞分辨率下染色质可及性、组蛋白标记和DNA甲基化的表观基因组分析技术。单细胞转录组与表观基因组的整合为研究单细胞水平的转录机制提供了强有力的策略（图2）。此外，单细胞转录组与蛋白质组的整合允许对细胞状态进行深入的表型表征。总之，这些综合分析结果有望发现脂肪组织功能领域中更多新的机制。

单细胞组学领域的一个重要发展是空间转录组学的引入，它提供了基因表达矩阵，可以整合有关组织结构、细胞特征和细胞相对位置的信息。这些技术可分为两类：（1）基于NGS的方法，即scRNA-seq的扩展，结合独特的位置条形码（Positional barcodes，提供空间解析的转录组信息）；（2）基于生物成像的方法，依赖于原位测序或杂交转录本的探针。由于脂肪组织的结构特征是许多不同类型的小基质血管细胞散布在充满脂质的大型脂肪细胞之间，其大部分体积内不含有转录本，所以基于固定矩阵玻片（Fixed array slide）的定位条形码技术可能具有挑战性。由此，可能需要提供真正的单细胞分辨率的技术，例如基于生物成像和杂交的技术。有前景的技术包括MERFISH（Multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization），它使用了大规模多路单分子FISH测量方法，进而在单细胞分辨率下量化数百至数万种RNA的空间分布。因此，实现这种基于高分辨率生物成像的技术对于理解脂肪可塑性和细胞微环境组成十分重要（图2）。

单细胞组学技术可以获取样本中所有捕获的细胞状态的“静止图像”。并且由于细胞数量众多，我们也可以推断细胞之间的关系。例如，与方向信息相结合，可以使用各种工具从scRNA-seq基于细胞间的相似性绘制细胞的发育轨迹或状态转变。此外，可以使用诸如CellPhoneDB、NicheNet等工具基于公共的配体、受体数据库绘制配体和受体间的对话和相互作用。这些工具使研究人员能够获取细胞分化的拟时轨迹和组织可塑性的机制。新兴的空间技术与单细胞技术的结合将为细胞间交流和组织微环境提供独特的见解。最后，来源于组织的单细胞转录组或表观基因组数据可以与遗传数据相结合，进而绘制不同细胞类型和细胞状态的表达数量性状位点（Expression quantitative trait loci，eQTLs），并推断疾病机制。

单细胞和单细胞核转录组学分析极大地扩展了我们对脂肪组织的细胞组成和异质性的认识。在接下来的章节中，我们总结了脂肪组织细胞图谱的现有研究，特别是运用了这些新技术的研究。

图 2. 通过单细胞/细胞核技术解析脂肪组织。单细胞/细胞核技术可用以研究脂肪组织的功能和组成的异质性。基于各种细胞/细胞核条形码化的单细胞/细胞核组学已广泛应用于整个脂肪组织以及组织的基质血管部分。新兴的空间转录组学技术包括依赖于独特位置条形码的第二代测序技术，以及基于依赖于原位测序或荧光探针与转录物的杂交的生物成像。

脂肪细胞异质性

白色脂肪细胞异质性

在前文已介绍，脂肪细胞对于整体生理活动十分重要，并且各种脂肪组织的代谢功能也不尽相同，因此，脂肪细胞的功能是如何被组织微环境所调控的是一个值得探讨的问题。最近的脂肪组织单细胞转录组研究揭示了多种脂肪细胞亚群在人和小鼠的WAT库中都存在（表1）。这些亚群除了表达经典的脂肪细胞表面标志物（如Adiponectin和Perilipin1）外，还会表达自身的表面标志物。在小鼠eWAT中，snRNA-seq鉴定了三种不同的成熟白色脂肪细胞亚群，它们的代谢和炎症基因表达存在差异。三种细胞亚群分别为：（1）成脂脂肪细胞（lipogenic adipocytes, LGAs）：高表达脂肪酸从头合成相关基因（如Acaca、Acly）；（2）脂质清除脂肪细胞（lipid-scavenging adipocytes, LSAs）：高表达脂吸收和脂转运相关基因（如Cd36、Apoe）；（3）应激LSAs（stressed LSAs, SLSAs）：除了表达Cd36和Apoe外，还表达缺氧和自噬相关基因（如Hif1a、Rab7）。有趣的是，在高脂饮食（HFD）诱导的肥胖中，LSA和SLSA亚群的相对比例增加，而LGA的相对比例下降。在细胞大小上，SLSA是最大的脂肪细胞，LGA的细胞尺寸最小，这与小的脂肪细胞对胰岛素敏感性更高的观点一致。关于细胞亚群相对丰度是如何变化的细胞和分子机制仍然未知。然而，脂肪细胞很可能在“细胞状态”之间转换，以响应胞外和胞内信号。LGA细胞亚群为了响应HFD诱导的肥胖而减少或许可以解释此前的一项发现，即在肥胖过程中，人和小鼠WAT中脂质从头合成以及胰岛素敏感性降低。最近，对小鼠iWAT和性腺WAT（gWAT，包括附睾WAT和卵巢WAT）的snRNA-seq分析中，研究人员鉴定出6种成熟脂肪细胞的亚群，这些亚群在不同的脂肪组织和性别中没有表现出差异性。一些细胞亚群可能与成脂信号相关（如mAd1、mAd4和mAd5），与LGAs相似，但是这些细胞亚群在肥胖的条件下却是增加的。出现这个差异的原因可能与小鼠的年龄或者性别相关，也与这些研究中HFD喂养的持续时间有关系。后续还需要更多不同HFD喂养时间的研究去确定不同脂肪组织中细胞可塑性的暂时性变化。

利用snRNA-seq在人内脏和皮下脂肪组织中鉴定出7种成熟脂肪细胞亚群，其中一些与成脂信号相关（如表达FASN、ACACA和DGAT1/2）。在这一研究中人和小鼠细胞亚群的重叠是有限的，但是与肥胖小鼠eWAT中LGA丰度降低相似，在人的皮下WAT库中，有一个成脂细胞亚群的丰度与BMI的增加呈负相关。一个较小但意义重大的脂肪细胞亚群似乎与平滑肌的功能相关，如钙离子处理/信号传递以及黏着斑（Focal adhesion）信号传递和细胞-底物连接等。

利用Visium空间转录组对人皮下腹部WAT进行分析显示，尽管其分辨率有限，但仍可以检测到三种成熟白色脂肪细胞亚群，它们表现出不同的转录组特点（表1）和空间组织特征。有趣的是，AdipoPLIN细胞亚群（高表达PLIN1/4）与LGA有相似的转录组特征，并且与体内更高的胰岛素敏感性相关。另一个细胞亚群AdipoSAA高表达脂质吸收与调控的基因，因此类似于小鼠中的LSA亚群；AdipoLEP细胞亚群和SLSA富集了相似的信号通路，即瘦素合成/信号转导以及ECM重塑（表1）。与小鼠中的LGA类似，AdipoPLIN脂肪细胞的相对丰度在肥胖的个体中是下降的。总之，所有的研究都证明在小鼠和人中脂肪组织含有一些共同的白色脂肪细胞亚群，即具有成脂能力的细胞亚群和参与脂质吸收的细胞亚群（图3）。接下来，了解这些细胞亚群的发育和分化轨迹是非常重要的，并需要确定一些成脂祖细胞是否可能产生特定的细胞亚群，以及组织微环境是如何影响细胞状态的。此外，确定不同脂肪细胞亚群在定义短期或长期的WAT可塑性方面的作用也是非常重要的。

表1 白色脂肪组织中的脂肪细胞亚群。利用sc/snRNA-seq在小鼠和人类的不同白色脂肪组织中鉴定出脂肪细胞亚群中富集的标记基因和功能。LGA，成脂脂肪细胞；LSA，脂质清除脂肪细胞；mAd1-6，小鼠脂肪细胞亚群；hAd1-7，人脂肪细胞亚群。AdipoLEP、AdipoPLIN和AdipoSAA亚群分别通过其高水平的LEP、PLIN 1/4和SAA 1/2的表达来定义。纵观不同研究，利用相似标志物基因的表达可以将脂肪细胞分为LGA、mAd1、AdipoPLIN、hAD4；LSA、mAd3/4、AdipoSAA、hAd3；SLSA、mAd5/6、hAd2/5；mAd2、hAd1/7。

图3. 白色脂肪细胞异质性。在不同的小鼠和人类脂肪研究中鉴定出的白色脂肪细胞亚群，并基于其基因表达和富集通路进行分类。此图显示了在小鼠和人WAT的不同研究中鉴定的四个不同亚群。缩略词定义同表1。

产热脂肪的异质性

对小鼠肩胛骨BAT的研究中，研究人员定义了10种棕色脂肪细胞的亚群，并且一些细胞亚群需要在特定的温度下才会被富集。一个以Cyp2e1和Aldh1a1为细胞表面标志物的细胞亚群（P4）在热中性的条件下丰度增加，而且似乎可以抑制产热能力，这个机制涉及到了乙醛脱氢酶1 A1合成的乙酸盐的旁分泌效应。在小鼠的腹股沟脂肪组织中同样也发现了具有相似转录组特征的脂肪细胞。利用snRNA-seq在人的BAT中发现的8个脂肪细胞亚群中，一些细胞亚群表现出与P4类似的转录组特征，但是其功能的相关性还有待探究。

之前在小鼠肩胛骨BAT的组织学和谱系追踪分析表明存在两种不同的棕色脂肪细胞亚群，一个细胞亚群高表达Ucp1和adiponectin（BA-H），另一个细胞亚群低表达Ucp1和adiponectin（BA-L）。这些细胞亚群表现出不同的细胞特征（如线粒体数量和脂滴大小）。对已发表的小鼠iWAT脂肪细胞的snRNA-seq数据进行多维重建后，定义了一个独特的产热细胞亚群（Ad1-Ucp1High），该细胞亚群在寒冷或β-肾上腺素激活后被诱导。这个细胞亚群与小鼠iWAT中的mAd6脂肪细胞亚群和人的hAd6细胞亚群相似，其特征在于高表达棕色化的标志物（如EBF2、ESRRG和PPARGC1A）。这些细胞亚群可能代表了米色脂肪细胞，如上所述，它们的可塑性很强，可以在静息状态和产热状态下转换。未来结合转录组学和染色质可及性分析的研究可能帮助我们预测和理解这种细胞状态变化和主要的转录驱使因子。

间充质干细胞的异质性

前体脂肪细胞和纤维成脂祖细胞

小鼠皮下iWAT和腹腔gWAT是首次发表的几项脂肪scRNA-seq研究的重点，旨在探究干细胞的异质性。这些研究的共识是：在成年小鼠的iWAT和gWAT中至少有两种分子和功能不同的脂肪干细胞的亚群。一个细胞亚群在体外培养和体内移植时均具有高度的成脂潜力，并且表达脂肪细胞的标志物（如Pparg、Lpl和Cd36），同时也普遍表达用于谱系追踪的间充质标志物（如Pdgfra和Pdgfrb），因此可以被认为是前体脂肪细胞（Preadipocytes）。这些细胞在两种脂肪组织中有许多名称（表2），包括脂肪祖细胞（APCs），脂肪干细胞1（ASC1），VAT间充质干细胞4/5（VmSC4/5），纤维成脂祖细胞1/2（FAP1/2），ES2/3，以及小鼠脂肪干细胞和祖细胞1/5（mASPC1/5）。此外，一些研究观察到了一个高度定型（Highly committed）的前体脂肪细胞亚群，该细胞亚群表达Adipoq和Lep，这是两种与脂肪细胞终末分化相关的谱系定义转录物。生物成像研究表明定型的前体脂肪细胞亚群似乎出现在脂肪血管周围，这与长久以来的假设一致，即脂肪前体细胞是脂肪血管周围间充质细胞的一个亚群。

第二个主要的细胞亚群缺少Pparg的表达，但是高表达ECM重塑和炎症相关的基因，这个细胞亚群同样在iWAT和gWAT中有很多名称（表2），如纤维炎性祖细胞（FIPs），Group 1/间质祖细胞（IPCs），ASC2，VmSC1/2，FAP3/4，CD34High细胞，ES1，富含胶原蛋白（C09）祖细胞和mASCP2/3。这些细胞在iWAT和gWAT中发挥着调控炎症、胶原蛋白的沉积和脂生成的作用。这种独特的间充质细胞亚群表现出许多骨骼肌FAPs的特性，因此被认为是脂肪细胞中的相应FAPs。在iWAT和gWAT中可根据 DPP4的表达水平（DPP4+）识别FAPs，已经有研究报道过，FAPs主要分布在脂肪细胞血管周围，但是它们在脂肪外缘的间隙区域内也很明显。可见，脂肪祖细胞存在于多个解剖学特异的祖细胞微环境中。重要的是，人的皮下脂肪组织中存在的FAP（DPP4+）和前体脂肪细胞（DPP4-）亚群和小鼠中的相似，表明成年人中也存在不同的祖细胞亚群，而且可以通过DPP4的表达来筛选。

表2 单细胞转录组学鉴定脂肪基质细胞亚群 单细胞/核RNA测序鉴定了WAT和BAT库中的脂肪基质细胞亚群，并总结了亚群的命名和定义转录物、功能特性、实验分离策略和组织定位。

脂肪组织、年龄以及性别依赖的脂肪祖细胞特性

基于scRNA-seq的转录组学分析表明，小鼠的皮下iWAT前体脂肪细胞和 FAPs与腹腔gWAT对应的细胞亚群相似，然而分离这些细胞亚群并进行功能分析却表明它们具有组织分布依赖的特性。较为明显的区别是分别从两种组织中分离的FAPs成脂潜力存在差异。从iWAT分离的前体脂肪细胞和FAPs，在体外或移植到小鼠后的分化能力较强。iWAT FAPs在形成脂肪细胞的过程中形成了定型的前体脂肪细胞，这个谱系关系与单细胞拟时序分析一致。同时，gWAT前体脂肪细胞和FAPs之间层次结构也与iWAT一致。然而，多种研究已经证明了成年gWAT FAPs在体外显著缺乏成脂潜力，即使在强促脂生成刺激（如Pparγ的激动剂）的存在下，它们同样缺乏成脂能力。此外，gWAT FAPs并不能像iWAT FAPs那样，移植到脂肪营养不良的小鼠中可以分化为脂肪细胞。重要的是，这些体外实验和体内移植实验并没有排除gWAT FAP在体内某些条件下可以分化为脂肪细胞的可能性。事实上，遗传谱系追踪表明eWAT中表达DPP4的FAPs确实低频率地经历了脂肪细胞分化，这一分化过程与HFD喂养有关。后续的研究需要完全理清每个脂肪组织中FAPs和前体脂肪细胞之间的发育关系，以及每个细胞亚群对体内脂肪组织维持和扩张所起的作用。

在一些scRNA-seq研究和细胞亚群分离后的功能研究表明，前体脂肪细胞和FAPs的功能都存在年龄依赖性变化。在iWAT中，一个小的间充质细胞亚群类似于出生后早期出现的前体脂肪细胞。在4周龄小鼠中的数据显示，这个被称为Aregs的亚群缺乏成脂能力，并且体外或体内移植实验证明会抑制其他脂肪干细胞的成脂能力。在人体脂肪组织中也具有类似Aregs亚群标记的细胞亚群，但这些细胞的功能性质还是未知的。另一个与年龄相关的干细胞亚群称为年龄依赖性调节细胞（ARCs），该细胞亚群在衰老小鼠的iWAT脂肪组织中特异性出现。ARCs分泌CCL6和其他的细胞因子抑制附近脂肪干细胞的分化和增殖，这些细胞可能是人类衰老过程中皮下脂肪组织体积和可塑性降低的原因。此外，从成年小鼠中分离出来的gWAT FAPs可以通过产生分泌因子的方式来抑制前体脂肪细胞的分化。FAPs的抗脂合成能力在围生期（围生期指小鼠分娩前一周到分娩后一周）并不明显，但其会随着年龄的增长发展。此外，当过表达Pparg或将gWAT FAPs暴露在PPARγ激动剂下时，与成年的gWAT FAPs相比，围产期的gWAT FAPs会表现出很强的脂合成能力。

脂肪组织重塑和功能方面的性别差异是被重点关注的，但是人们很少聚焦于性别差异在前体脂肪细胞或FAP功能中所起的作用。对分离的干细胞亚群进行大量的蛋白质组学分析，强调了与线粒体功能和脂质代谢相关基因表达的巨大的性别差异。这些发现可以给研究者们一些启示：脂肪祖细胞的功能和分子特性是脂肪组织、年龄以及性别依赖的。年龄和脂肪组织在脂肪干细胞亚群中的差异仅靠单细胞转录组学是不能被轻易地分辨出来的。因此，在设计、整合以及解释与干细胞相关的研究时，应该仔细考虑这些生物变量。

米色脂肪祖细胞

scRNA-seq也已经被用于鉴定小鼠iWAT中假设的米色脂肪祖细胞。研究者利用scRNA-seq的Fluidigm C1平台鉴定出一种高表达CD81的PDGFRa+ Sca1+细胞亚群。与之前的谱系追踪研究一致，CD81High祖细胞表现出血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell， VSMC）的表达图谱（富含Acta2和Sm22转录本），表明平滑肌细胞谱系对于米色细胞的形成具有重要贡献。与CD81Low相比，CD81High细胞在体外具有更高的成脂能力，并且在体内移植和冷刺激下分化成米色脂肪细胞的能力也更强。利用CD81-CreERT2小鼠模型对CD81+细胞进行遗传谱系追踪，结果表明在冷刺激下，表达CD81的细胞可以增殖、分化为iWAT米色脂肪细胞。在机制上，CD81代表了米色脂肪祖细胞的功能性标志。CD81与整合素形成了复合物，介导irisin诱导的整合素-FAK信号级联信号通路。重要的是，CRISPR介导的Cd81失活减弱了冷诱导的米色脂肪生成。此外，与小鼠的数据一致，在人的皮下WAT中，CD81+细胞数量下降是代谢风险增加的一个指标，表明米色脂肪细胞的生物发生影响了整体代谢健康。CD81在iWAT PDGFRa+细胞亚群中表达量高，该细胞富集在前面所提到的DPP4-前体脂肪细胞中。然而CD81祖细胞是否能够在条件允许的情况下形成白色脂肪细胞仍然是未知的。

经典的棕色脂肪祖细胞

在成年的小鼠中，对寒冷环境温度的适应主要涉及两个方面，即BAT中已存在的棕色脂肪细胞的活化和祖细胞的从头分化。对小鼠进行冷暴露（5℃）2天或7天后，对BAT SVF进行scRNA-seq分析，随后进行细胞谱系轨迹分析，结果表明了表达TRPV1的VSMCs很可能是冷诱导的棕色脂肪细胞的祖细胞。利用Trpv1-Cre进行谱系追踪支持了这一假设，并且表明了遗传标记的Trpv1亚群在冷暴露下会发生增殖，分化为标记的产热脂肪细胞。Trpv1在BAT中似乎特异性的在VMSCs中表达，因此，这些数据支持了脂肪细胞周细胞（mural cell）起源的概念。

然而，产热脂肪细胞组织中独立的单细胞分析表明，多个基质细胞亚群可以生成产热脂肪细胞。在冷暴露后的BAT SVF进行scRNA-seq分析，结果鉴定出了多种具有不同组织定位、表达Pdgfa的成纤维细胞亚群。一个被称为ASC1的细胞亚群在冷暴露下增殖，并可以分化。遗传追踪证明了表达Pdgfa的细胞在冷暴露下会发生棕色化。重要的是，这些表达Pdgfa的成纤维细胞不同于Trpv1+ VSMCs，证明在冷诱导的iBAT棕色化的过程中，多种祖细胞细胞亚群同时发挥作用。

主动脉血管周围脂肪组织（PVAT）与iBAT有几个共同的特征，并含有独特的棕色脂肪祖细胞谱系。围产期小鼠的PVAT scRNA-seq分析支持了棕色脂肪细胞祖细胞异质性的概念，还表明了VSMCs和多种表达Pdgfa的成纤维细胞亚群（包括定型的前体脂肪细胞（Pparg+）和干细胞样间充质祖细胞）类似于iWAT中鉴定的多能干细胞（Pi16+）。在围产期，前体脂肪细胞和FAPs可以在体外分化为棕色脂肪细胞，但是VSMCs却不行。同样的祖细胞亚群也存在于成年小鼠的主动脉PVAT中，而这里的Trpv1+VSMC可以分化为棕色脂肪细胞。使用Myh11-Cre谱系追踪证明了VSMCs有利于维持成年小鼠PVAT中棕色脂肪细胞的数量。总之，这些数据证明了组织可以利用多种祖细胞亚群维持自身功能，如PDGFRa+干细胞驱使组织发生，成脂的VSMCs有助于维持成年小鼠的组织稳态。此外，这些数据也进一步强调了这些细胞亚群的成脂潜力是如何随着时间的变化而变化的。

非典型的脂肪组织：皮肤和骨骼脂肪基质细胞

近些年来，一些具有可塑性的脂肪组织仍研究不足，其中之一就是皮肤白色脂肪组织（Dermal white adipose tissue，dWAT），它在很多的生物过程中（如局部感染、毛发循环和伤口愈合）都发挥作用，如参与了与毛发循环和伤口愈合相关的脂肪量的扩张和收缩。scRNA-seq研究推动了dWAT中脂肪细胞可塑性的发现，对成熟脂肪细胞的谱系追踪和scRNA-seq分析揭示了成熟脂肪细胞在病理、生理条件下去分化为FAP样细胞，之后又可以再分化为成熟脂肪细胞。通过scRNA-seq，在哺乳期和退化期的乳腺重塑，以及响应肿瘤微环境的脂肪重塑中也发现了这一成熟脂肪细胞回到更原始谱系状态的现象。因此，scRNA-seq在揭示之前没有认识到的谱系关系方面发挥了重要作用。

骨髓脂肪细胞（Bone marrow adipose tissue，BMAT）是另一个具有极高重塑性和异质性的脂肪组织。scRNA-seq已经被用于探究骨骼间充质基质细胞的异质性，细胞轨迹分析定义了多种代表不同谱系时期的祖细胞亚群，并发现了一种定型的前体脂肪细胞表达Adipoq，Pparg，Cebpa，和Lpl，但是缺少Plin1和脂滴，这些细胞被称为骨髓脂生成谱系祖细胞（MALPs），与周细胞很相似。MALPs在骨髓毛细血管中很容易被发现，它们表达Pdgfb并且与内皮细胞共享一个基底膜。MALPs表达大量的成脂因子（如Vegfa），当敲除这些细胞时，会导致整体血管密度的丧失。MALPs的发现加强了周细胞样细胞有利于脂肪生成的概念，并且进一步强调了脂肪祖细胞在调节组织稳态中的多方面作用。

免疫细胞异质性

肥胖相关的ATMs

脂肪组织巨噬细胞（Adipose tissue macrophages，ATMs）在脂肪组织稳态和适应性重塑中起着重要作用。肥胖的形成与骨髓来源的单核细胞向脂肪组织大量募集有关，其导致ATMs大量积累，进而促进低程度的炎症和胰岛素抵抗。在肥胖状况下，ATMs最初被认为向促炎性M1巨噬细胞极化。然而，对小鼠和人类脂肪免疫细胞群的深入分析挑战了这一观点，提示肥胖更倾向于促进ATMs对脂质的摄取、储存和分解代谢。最近，单细胞技术已经完全解析了脂肪免疫细胞的异质性和可塑性（图4），这些研究都支持ATMs不向经典的M1和M2巨噬细胞极化的观点。相反，人和小鼠脂肪免疫细胞的scRNA-seq或整个脂肪组织的snRNA-seq表明，巨噬细胞亚群具有多种细胞状态，其中一些更具有促炎性，而另一些则更具有代谢活性。重要的是，使用MacSpectrum工具根据巨噬细胞的极化和分化指数（Differentiation indexes）对所有巨噬细胞进行细致的计算分析，表明它们不会简单地极化为经典M1和M2状态。

    有趣的是，最近对小鼠和人类肥胖状态下的Lin+细胞的高分辨率scRNA-seq分析、小鼠eWAT的CITE-seq分析以及小鼠eWAT和人类WAT的全组织snRNA-seq结果表明，肥胖诱导了一个独特的以Cd9和Trem2标记的ATM亚群。该亚群表达高水平的脂质处理基因，包括Cd36、Lpl和Lipa，现在被普遍称为脂质相关巨噬细胞（lipid-associated macrophages，LAMs）（表3）。LAMs在CLSs部位富集，它们在脂肪组织重塑中发挥重要的Trem2依赖性作用。此外，一些研究报告了一个较小的表达增殖基因的LAMs亚群，因此被称为增殖LAMs（Proliferative LAMs，P-LAMs）或细胞周期巨噬细胞（Cell-cycling macrophages，CMs），表明LAMs亚群扩大不仅仅是通过单核细胞的募集和激活，还可以通过局部增殖。除了LAMs外，高表达炎症基因程序的炎性巨噬细胞（Inflammatory Macrophage，IM）亚群已被证明与肥胖呈正相关。

    单细胞分析也探究了减肥过程中的巨噬细胞亚群。通过对小鼠减肥期间eWAT的CITE-seq的分析显示，LAMs随着体重减轻而减少。然而，尽管身体和脂肪组织重量回归了正常水平，但组织中LAMs的丰度仍然高于瘦对照组。此外，研究中体重反弹组的LAMs快速增加，并且超过肥胖组，这表明这些细胞可能编码肥胖记忆相关的基因，进而导致减肥后的反弹。

尽管肥胖相关的ATMs在不同的脂肪组织和物种中存在明显差异，但代谢和炎症基因表达在各组织和物种中相对保守（表3）。最近对小鼠和人类WAT的直接比较显示，不同物种和组织中分布的骨髓和淋巴细胞群相对丰度存在差异（表3）。然而，各个巨噬细胞亚群的转录谱明显相似，然而这项研究似乎没有在Trem2+ LAMs中检测到脂质处理基因表达。

图4. 脂肪组织的髓系细胞组成。小鼠和人类脂肪组织的髓系细胞的肥胖相关重塑。VAM/PVM和ncMos在瘦脂肪组织中丰富，而在小鼠以及人的肥胖发展期间，LAM、IM和Mos发生富集。LAM，脂质相关巨噬细胞；PVM，血管周围巨噬细胞；IM，炎性巨噬细胞；Mos，单核细胞亚群Mo 1和Mo 2；ncMos，非典型单核细胞。

血管相关巨噬细胞或血管周围巨噬细胞

对不同脂肪组织和物种的研究中发现了表达与血管发育和细胞外基质重塑和维持相关基因的巨噬细胞亚群。众多研究一致表明，这些由Lyve1标记的血管相关巨噬细胞（Vascular-associated macrophages，VAMs）或血管周围巨噬细胞（Perivascular macrophages，PVMs）可能是瘦个体WAT中最丰富的组织常驻巨噬细胞（Tissue-resident macrophages，TRMs）。VAMs和PVMs的相对丰度已被证明随着肥胖而降低，然而目前尚不清楚这是由于PVMs向IMs的转化增加（如RNA速率分析所示，还是主要由于LAM和IM亚群的大量增加有关。有趣的是，在急性禁食后，研究者观察到eWAT中VAMs丰度减少。值得注意的是，VAMs和PVMs共同表达M2样标记物（如Mrc1、Clec10a和Cd163）和参与调节补体功能和血管生成的基因（表3）。此外，在小鼠eWAT中，一小类高表达胶原蛋白（特别是Col3a1和Col5a2）的ATMs亚群，已被鉴定为表达胶原蛋白的巨噬细胞（CEMs）。

拓展阅读：RNA速率分析

RNA丰度是分析单个细胞状态的强力指标，而scRNA-seq能高准确度、高灵敏度和高通量地定量RNA丰度。然而，这种方法只能捕获细胞亚群在某个时间点的静态状况，难以研究该细胞亚群在跨时间维度上的变化。于是La Manno等人于2018年在Nature杂志上发表《RNA velocity of single cells》，提出了RNA速率分析方法，即基因表达状态的时间导数。在常见的单细胞RNA测序方案中，可以通过新生（未剪接）和成熟（剪接）mRNA的相对丰度来估计基因剪接和降解的速率，区分未剪接和剪接的mRNA，进一步直接估计细胞基因表达的动态分化。刚转录出的mRNA包含外显子和内含子，经过RNA剪接切除内含子后，得到用于编码蛋白的成熟mRNA。该mRNA的丰度由未成熟mRNA的剪接速率和降解速率共同决定。通过计算未剪接转录本和剪接转录本之间的比率来推断细胞命运的状态和方向性。

参考文献：

[1] La Manno G, et al. Nature. 2018;560(7719):494-498.

表3 脂肪组织中的巨噬细胞亚群。小鼠和人WAT和BAT中的脂肪组织巨噬细胞（ATM）亚群。总结了亚群的命名、特定标记基因、富集途径和极化方向。与肥胖的关联分为+（正相关）、++（强正相关）、-（负相关）或无相关。Mac1-3、mMac1-4（小鼠）和hMac1-3（人）是巨噬细胞亚群。IS2/3/9是巨噬细胞的免疫亚群。LAM，脂质相关巨噬细胞； PVM，血管周围巨噬细胞；NPVM，非血管周围巨噬细胞；CM，表达胶原的巨噬细胞； P-LAM，增殖LAM；RM，调节性巨噬细胞；TRM，组织驻留巨噬细胞；CM，细胞周期巨噬细胞；IM，炎性巨噬细胞。纵观不同研究，利用相似标志物基因的表达可以将巨噬细胞分为CD11b+ Ly6c+、Ly6c-CD9-CD206+、Mac1、PVM、TRM、M2样巨噬细胞、hMac3；Ly6c-CD9+、mac3、LAM、P-LAM、Lplhi巨噬细胞、Plin2hi巨噬细胞、IS2、mMac3、M1样巨噬细胞、hMac2；CEM，基质巨噬细胞；IS3、IM。

单核细胞异质性及其与ATM亚群的联系

单细胞研究也在小鼠eWAT中发现了两个单核细胞亚群，称为Mon 1（经典）和Mon 2（非经典），而在人类sWAT（Mo-1, Mo-2和非经典）和小鼠iBAT （Ly6clow, Ly6cint和ly6chigh）中报道了三个亚群（表4）。有趣的是，RNA速率分析表明Mo-1s在人类sWAT中产生PVM和IMs，而在肥胖中，Mo-2s代表了Mo-1s和IMs之间的过渡状态。在肥胖期间，Mo-1似乎优先转变为IMs，而PVMs则转变为LAMs。

表4 脂肪组织中的其他髓系细胞亚群。小鼠和人的白色和棕色脂肪组织中单核细胞和树突状细胞的亚群，由特定标志物基因的表达定义。它们与肥胖的相关性分为+（正相关）、++（强正相关）、-（负相关）或无相关。Mon1/2和Mo1/2，单核细胞亚群； ncMos，非典型单核细胞；cDC，常规树突状细胞。

BAT中的ATM亚群

    单细胞分选和转录组分析也可以广泛表征BAT的单核细胞和巨噬细胞亚群,其中许多结果似乎与WAT中发现的一致。例如，与eWAT类似，BAT也含有与脂质相关的Lplhi和Plin2hi亚群、M2样和基质巨噬细胞（表3）。然而，仍需进一步分析来确定这些亚群在不同脂肪组织之间的功能相似性。BAT中单核细胞亚群的轨迹分析表明，Ly6chigh单核细胞可以形成LAMs，并进一步分化为终末分化的M2样或基质巨噬细胞。

树突状细胞

此前的研究表明脂肪组织树突状细胞（Adipose tissue dendritic cells，ATDCs）与肥胖有关，现下通过单细胞/核分析已经在小鼠和人类WAT中确定了DCs中的免疫调节细胞亚群。DCs的两个典型亚群（conventional DCs, cDC1和cDC2）在小鼠eWAT和人类sWAT中被发现。同时在人类中，可以根据特定的基因表达定义cDC2的另外两个亚群（cDC2A和cDC2B）（表4），而小鼠ATDCs可以根据其激活状态（Ccr7表达）和增殖标记物进一步分类。此外，单核细胞来源的DCs （Monocyte-derived DCs，moDCs）在瘦小鼠WAT中富集。有趣的是，激活的cDCs在肥胖小鼠中升高，并且在体重减轻后无法恢复。

淋巴细胞

现下，尚不清楚脂肪组织中淋巴免疫细胞的异质性和可塑性。最近的研究表明，脂肪组织淋巴细胞也可聚类分群，其中一些对产热信号更敏感，另一些对致肥信号更敏感。在小鼠iWAT/eWAT和人类sWAT中发现了多个组织常驻T细胞亚群（初始T细胞，记忆T细胞和调节T细胞）和B淋巴细胞。其中，人皮下和大网膜脂肪组织中的记忆T细胞亚群（CD8+，CCL5+）以及小鼠eWAT （CD8+ TEM）随着肥胖而增加。此外，人类sWAT驻留免疫细胞的scRNA-seq鉴定出脂肪驻留自然杀伤细胞（NK）和先天淋巴细胞的亚群（ILCs）。对不同ILCs的发育轨迹和炎症相互作用的研究发现，ILC3亚群与肥胖呈正相关。有趣的是，iWAT驻留免疫细胞亚群经历冷诱导可由髓细胞向淋巴细胞转变。 

间皮细胞和内皮细胞异质性

人类和啮齿类动物的腹腔内WAT都含有一种明确的间皮，它由鹅卵石状单层细胞组成，具有混合的间充质/上皮表达谱。这一层细胞的主要功能是在腹腔内提供一个保护性的、无粘附力的表面。然而，目前推测脂肪相关的间皮细胞具有其他功能。人类WAT的研究表明，这些细胞在肥胖中展现促炎表型。

小鼠谱系追踪研究提示腹腔内脂肪细胞起源于间皮细胞。然而，最近的研究利用更特异的靶向上皮细胞的Cre（Krt19-Cre）小鼠后，并没有发现脂肪细胞起源于间皮细胞的证据。单细胞/核转录组学为这些细胞提供了前所未有的视角，并确定了不同的间皮亚群，这些亚群在小鼠和人类之间很大程度上是保守的，但在肥胖中似乎受到不同的调节。

内皮细胞是脂肪组织中另一种重要的上皮细胞类型。内皮细胞在调节营养转运、激素信号和炎症中的功能是明确的。然而，这些细胞在脂肪组织中的潜在异质性仍未得到充分研究。单细胞/细胞核转录组学研究强调了小鼠和人类WAT中存在多个内皮亚群，包括小动脉，静脉和淋巴管内皮细胞。其中一个亚群高表达CD36和其他参与脂质代谢的基因，可能代表了“脂质处理”内皮细胞。内皮细胞的多样性也通过其他几种组织的scRNA-seq分析进行研究，将这些数据与脂肪组织的类似数据相结合，可能有助于揭示内皮细胞的WAT特异性。

利用单细胞组学探究细胞机制

细胞间通讯

脂肪细胞与脂肪组织微环境中其他细胞之间的通讯对于脂肪组织稳态和适应环境、生理挑战至关重要。在单细胞分辨率下解析脂肪组织转录组的能力，结合新兴的计算工具，可以预测以前未被识别的细胞间信号。该预测方法可以基于已知的配体-受体对在不同细胞中的表达。因此，该方法可用于预测eWAT中作用于前体脂肪细胞受体的潜在成脂配体，并预测小鼠和人类肥胖中脂肪细胞与脂肪祖细胞或内皮细胞之间的相互作用。类似地，配体受体表达可被用来推断脂肪组织内的细胞间交流以及运动训练中潜在的肌肉-脂肪组织对话。这些计算方法具有巨大的预测潜力，然而需要进一步的实验研究来验证预测。

最近，从脂肪前体细胞亚群的单细胞转录组数据中发现了几个细胞间通讯的具体例子（图5）。例如，R-spondin2（RSPO2），一种WNT信号的增强子，被鉴定为在Areg亚群中富集的分泌蛋白。RSPO2靶向FAPs中富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4（LGR4），抑制它们向更为定型的前体脂肪细胞状态分化。同样，脂肪祖细胞的scRNA-seq和后续多组学分析发现了缺氧诱导因子（HIF）1α依赖的抑制信号机制，该机制是小鼠iWAT和gWAT在高脂饲养开始后前体脂肪细胞具有性别和组织分布活性差异的基础。具体而言，激活的HIF1α信号驱动PDGFs的产生和分泌，PDGFs以自分泌/旁分泌的方式驱动PDGFR-ERK信号级联，最终抑制PPARγ Ser112的磷酸化。

另一个讨论的重点是特定基质细胞亚群和不同免疫细胞类型之间的细胞间通讯。通过将NicheNet应用于单细胞转录组学数据，研究人员提出，肥胖中积累的衰老CD9+巨噬细胞通过分泌因子（如骨桥蛋白）阻断了基质细胞的成脂潜能。免疫细胞和脂肪祖细胞之间的交流是双向的。在高脂饲喂的头几天，eWAT FAPs显著高表达促炎细胞因子（如IL-6和Ccl2）和ECM组分，其程度远高于前体脂肪细胞。遗传小鼠模型支持FAPs激活在饮食诱导肥胖相关的代谢性脂肪组织炎症中的作用。针对eWAT前体细胞的scRNA-seq研究已经揭示了白细胞介素33（IL-33）在瘦成年小鼠FAPs中的选择性表达。IL-33促进调节性T细胞（Tregs）的活性，Tregs是维持脂肪组织抗炎表型的关键免疫细胞。Pdgfra表达细胞（包括FAPs）中Il33的失活可减弱性腺脂肪组织中Treg的积累。这些结果表明，在稳态条件下，eWAT FAPs在调节脂肪免疫细胞组成中发挥作用。

在iWAT中，FAPs是IL-33的主要来源，在急性冷暴露后，这些细胞通过激活β-肾上腺素能受体/CREB信号来诱导IL33表达。在产热重塑中，IL-33驱动ILC2s的募集和激活，以增强米色脂肪细胞的积累。同期的研究支持并扩展了这些观察结果，并表明在FAPs的Bst2High亚群中IL-33的表达丰富（该亚群存在于iWAT的淋巴结附近，且此前发现此区域在冷暴露后富含米色脂肪细胞）。手术切除iWAT淋巴结可减少米色脂肪细胞的积累，提示淋巴结可能提供了调节冷刺激诱导棕色化的关键信号。综上所述，scRNA-seq研究表明脂肪祖细胞与免疫细胞之间的交流在调节组织稳态和适应环境挑战中具有重要作用。

图5. 单细胞组学分析提供的重要见解。单细胞组学揭示了体内脂肪形成、基质细胞-免疫细胞交流和内在调节因子介导的组织重塑。拟时序分析揭示了不同的基因模块，这些基因模块在成脂过程中在早期/晚期被抑制、诱导或短暂抑制。间充质基质细胞，包括前体脂肪细胞和FAPs，分泌大量胶原和细胞外基质(ECM)调节因子，从而导致与肥胖相关的病理性组织纤维化。这些细胞还能分泌血管生成因子，促进血管生长/稳定。此外，脂肪基质细胞分泌的蛋白质以自分泌或旁分泌的方式调控脂肪细胞的功能，它们通过产生促炎因子（如MCP1和IL-6）和抗炎因子(如IL-33)来调节局部免疫细胞的组成。重要的是，巨噬细胞可通过分泌因子(如骨桥蛋白)的产生来影响脂肪祖细胞的成脂和成纤维活性。

分化轨迹和转录驱动因子

脂肪组织snRNA-seq分析的一个重要作用是能够应用拟时序轨迹分析工具来解析体内脂肪形成的不同阶段。使用这种方法，从早期前体脂肪细胞，到晚期前体脂肪细胞，以及过渡细胞到成熟脂肪细胞的脂肪形成轨迹可以在瘦和肥胖个体的eWAT中绘制出来。研究发现，很少有过渡细胞可以被检测到，并且晚期前体脂肪细胞似乎在向成熟脂肪细胞过渡之前积累，这表明存在对分化信号高度敏感的亚稳态。此外，这些发现提示了存在一种诱导分化的“开关”机制。一个有趣的问题是，何种诱因和驱动因子控制这一开关。基于对体外成脂的二十多年的研究，诱导分化的主要因素似乎是超过一定阈值水平的主调节因子PPARγ的激活。拟时序分析揭示了体内脂肪形成过程中基因程序的顺序表达，包括可能驱动脂肪细胞基因激活的转录调节因子的时间表达。这种类型的分析与单细胞表观基因组研究相结合，将有助于深入了解驱动细胞转变的转录机制，包括体内脂肪形成。

展望、挑战和机遇

单细胞转录组学和相关分析工具的快速发展完全颠覆了我们对脂肪细胞、间充质干细胞和脂肪组织中免疫细胞的不同亚群的理解。这些新的细胞亚群的发现为脂肪组织在不同年龄、解剖位置和性别的条件下适应并重塑的复杂机制提供了新的见解。下一步，确定不同细胞亚群在特定性别、年龄和组织特异性功能，以及它们在调节WAT的短期和长期可塑性（包括代谢功能）上发挥的作用是十分重要的。

细胞亚群标志物的鉴定使研究脂肪组织生物学的经典策略得到了改进。特别是，基质细胞的新细胞表面标记物的鉴定促进了利用FACS进行细胞分离和功能分析的新策略发展，这使得研究人员可以利用原代细胞和永生化前体脂肪细胞系来进一步进行经典细胞培养研究。

然而，对脂肪组织内和组织间异质性的日益重视，给该领域的研究人员带来了许多问题和挑战。例如，在特定脂肪组织中鉴定的特定脂肪细胞和脂肪祖细胞亚群是拥有特定细胞起源和稳定内在特征的独特细胞亚型（例如棕色脂肪细胞与白色脂肪细胞），还是这些不同的细胞亚群代表着可相互转换的细胞状态？是否存在超出当前解析方法的更深层的组织异质性？单细胞RNA-seq的测序深度会限制在细胞群中定义细微差异的能力。此外，就功能而言，定义单个细胞亚群的意义是什么? 由于缺乏针对脂肪细胞、脂肪祖细胞或免疫细胞亚群的特异性策略，研究细胞亚群的功能重要性及其在体内的信号特性是一个巨大的挑战。基于两个特定基因表达的交叉-CRE策略的发展可能有助于特异靶向细胞亚群。此外，细胞表面受体也能够帮助我们特异靶向特定细胞亚群。

此外，一个主要的挑战是探究细胞间交流及其在调节细胞亚群中的作用。高分辨率空间组学技术的出现，包括空间转录组学方法，是理解细胞亚群及其微环境的重要下一步。空间组学数据与单核转录组学或表观基因组学数据的整合为深入了解细胞间信号在脂肪组织可塑性中的作用提供了强有力的方法。

最后，随着该领域的发展，整合从各个研究中收集数据集的过程必须依赖于统一的命名法和准确的原始数据，进而能够对生物变量进行计算。复杂的脂肪组织必然会导致研究过程中困难重重。然而，逐一破解这些挑战将会完全解析脂肪组织保持健康的自然细胞和分子机制，并确定病理性肥胖干扰了哪些机制，同时极大地促进针对脂肪组织的健康和功能地治疗策略的发展，作为预防和治疗代谢疾病的一部分。