代谢学人

Cell Stem Cell：改写衰老宿命，让细胞“青春永驻”

撰文| 胡敏 马莹 张俊 武霞 陈江榕 郭明伟 编辑| 孟美瑶 校对| 张俊

背景介绍

衰老是一种以细胞衰老和组织功能衰退为特征的全身性退化。衰老细胞表现出稳定的增殖阻滞，伴随多种细胞和分子改变。积累的衰老细胞在各种与衰老相关的疾病中起着有害的作用。相反，靶向衰老细胞可以改善机体病理特征（如动脉粥样硬化、骨关节炎和纤维化），减轻炎症，延长寿命。干细胞和前体细胞由于其分化和自我更新的特性，在整个生命周期中对维持组织稳态和再生至关重要。越来越多的证据表明，年龄导致的干细胞更新和分化缺陷是组织和机体衰老的驱动因素。因此，在衰老过程中补充具有强大再生能力的干细胞至关重要。

有证据表明，干细胞在正常和病理衰老过程中表现出表观遗传失调和转录中断。最近，通过短期强制表达Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc（OSKM）（小编注：这是日本科学家山中伸弥在2006年报道的四种转录因子（Oct4、SOX2、Klf4与c-Myc），可以介导细胞重编程，可以将成熟分化的细胞转化为多能干细胞），建立了细胞重编程方法，以恢复衰老细胞的活力，改善组织修复，甚至延长寿命。这一策略表明，通过鉴定和操纵恢复活力的因子，有可能重新建立年轻有关的分子程序，进而延缓细胞到机体水平的衰老。然而，目前对在恢复衰老干细胞活力的同时保持其原始细胞特性的机制仍知之甚少。

CRISPR-Cas系统是细菌抵御外来物质入侵的一种天然免疫系统，它包含CRISPR基因座和Cas基因两部分。目前，应用最为广泛的CRISPR系统是CRISPR-Cas9系统。该系统中的Cas9蛋白（具有核酸内切酶功能）和sgRNA结合靶向到基因组特定位点，进而Cas9切割DNA产生双链断裂（Double strand breaks，DSB），随后细胞启动DNA修复机制，包括非同源重组（Nonhomologous end joining，NHEJ）和同源重组（Homology directed repair，HDR）。然而，在NHEJ修复过程中，通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，进而实现基因敲除；在HDR修复过程中，如果细胞已导入DNA模板，那么细胞将会将该DNA作为模板进行HDR修复，进而实现基因敲入。除此之外，Cas9可通过点突变而失去核酸内切酶活性，但保留了结合sgRNA和靶向基因组的功能，称为dCas9（Nuclease-dead mutants of Cas9）。将dCas9与转录激活因子融合表达，可使其靶向基因的转录起始位点（Transcription start sites，TSS），进而促进基因转录，该系统称为CRISPR激活（CRISPR activation，CRISPRa）。但如果融合表达转录抑制因子（如KRAB），可以特异抑制基因转录，其效果显著高于RNAi，该系统称为（CRISPR interference，CRISPRi）。

近年来，基于CRISPR-Cas9的基因筛选已被用于全面揭示涉及许多生物过程的调控网络，建立了一种基于CRISPR激活（CRISPRa）策略，称为协同激活介质（Synergistic activation mediator，SAM），用于功能获得筛选。这种方法通过同时使用靶向不同基因转录起始位点（TSS）的 sgRNA，以单个基因/每个细胞的方式直接内源激活单个基因的表达，这使得它比使用供体 DNA 或开放阅读框 (ORF) 的传统基因表达方式更具可扩展性和可获取性。从理论上讲，CRISPRa 筛选技术非常适合用于识别在复杂的衰老相关调控网络中被下调，但其内源性过表达能有效延缓衰老的核心因子。然而，迄今为止，尚未使用全基因组CRISPRa筛选技术对抗衰老的重编程或再生因子进行系统的鉴定。Werner综合征（WS）蛋白（WRN）是DNA解旋酶RecQ家族中的一员，在DNA复制、转录、修复、重组和异染色质维持中发挥重要作用。WRN基因的突变导致了WS的表现，这是一种以加速衰老为特征的疾病。研究人员利用携带WRN基因纯合子缺失的人类胚胎干细胞衍生的人间充质前体细胞（hMPCs）建立了一个早衰模型，该模型显示了多种与衰老相关的特征，并以此来解析干细胞衰老的关键转录因子和表观遗传调控因子。因此，在WS hMPCs中应用CRISPRa筛选，可以在全基因组范围内解析干细胞衰老的决定因素。

本文中，研究人员使用CRISPRa系统在WS hMPCs中进行全基因组范围内的功能获得筛选，确定了一组针对衰老hMPCs的潜在再生因子，并且大部分是以前未知的干扰细胞衰老的因子。其中，研究人员验证了排名最高的基因，发现SRY盒转录因子5（SOX5）单一转录因子的过表达，足以触发表观遗传和转录重构，导致高迁移率族蛋白2（HMGB2）等衰老保护基因的激活，进而缓解细胞衰老。此外，他们还发现SOX5慢病毒递送可减轻老年小鼠的年龄依赖性关节退变并改善骨关节炎。因此，靶向SOX5作为一种潜在的衰老干预疗法，值得进一步探索。

敲黑板啦！

1. CRISPRa筛选确定了一套全面的抗衰老因子；

2. SOX5的激活通过表观遗传重塑引发再生程序；

3. SOX5激活HMGB2增强子，实现随后的衰老保护作用；

4. 单独使用SOX5进行基因治疗可促进老年膝关节的再生。

研究结果

1 CRISPRa筛选缓解衰老的再生因子

为了系统地定义人类干细胞中的再生因子，研究人员将CRISPRa筛选应用于WS hMPCs中，使用增殖能力作为功能读数。他们利用WRN-knockout（KO）hESCs生成WS hMPCs，其表现出自我更新受损和与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加，这是细胞衰老的共同特征（图S1A-S1E）。详细的说，他们首先将转录激活因子CRISPR复合体（dCas9-VP64-p65-HSF1）转导到WS hMPCs中，然后以低感染复数（MOI）慢病毒递送SAM文库（小编注：常规CRISPR Screening的方法中，为了避免“搭车效应”，即一个细胞中导入多种sgRNA而干扰其功能，通常在进行sgRNA慢病毒感染时使用低MOI进行感染，一般为0.3左右，同时进行多个生物学重复进行验证，进而保证每个细胞最多导入一个sgRNA慢病毒）（图1A）。该基因组规模的SAM文库包含70,290个sgRNAs，靶向23,430个人类RefSeq编码亚型的TSSs上游200bp区域，每个亚型有3个sgRNAs。将WS hMPCs与慢病毒SAM库或对照（sg-NTCs）连续培养和传代6周后，他们观察到在SAM文库转导后，该组中“年轻”细胞显著富集（图1B）。这些细胞的更新再生体现在Ki67阳性细胞的比例增加（图1C），低比例的SA-β-gal-阳性细胞（图1D），和核结构的改善，包括核体积减小、核膜内折和染色质收缩（小编注：在衰老细胞中，维持细胞核结构稳定的核纤层降解增加，导致细胞核结构异常，表现为细胞核体积增大、核膜松散和染色质疏松）（图1E和S1F），而sg-NTCs转导的WS hMPCs显示出加剧的衰老表型，导致筛选结束时细胞数量急剧减少（图S1G）。这些结果表明，CRISPRa激活某些基因可以改善WS hMPCs的细胞衰老。

当具有sg-NTCs的细胞组表现出生长停滞时，研究人员从用SAM文库转导的WS hMPCs中收集基因组DNA，并通过靶向扩增子（amplicon）深度测序捕获富集的sgRNAs（小编注：不同于RNA-seq，CRISPRa筛选中的测序部分使用的样本是gDNA，因此不能通过转录增强后的转录本来进行测序，只能通过检测sgRNA结合到基因启动子的数量来判断影响衰老的关键基因。其次，由于sgRNA是通过慢病毒转染进细胞中，所以这段序列会整合到细胞基因组DNA中，当PCR扩增sgRNA文库并进行深度测序，一方面可以判断是否丢失大量sgRNA，实现质控目的（如果出现大量丢失可能影响最终的筛选结果）。另一方面，可以直接通过sgRNA的read读数来寻找关键靶基因。具体而言，在本文中，WS hMPCs当含有靶向抗衰老基因的sgRNA时，细胞能够显著增殖再生，进而这些sgRNA得到富集，而它们靶向的基因即候选基因，随后便可进行常规的差异基因富集分析）。进行2个生物学重复，进一步分析2个重复中富集的sgRNAs（图1F、S1H和S1I）。GO和KEGG分析显示，富集到的sgRNAs的靶向基因与RNA聚合酶II介导的转录和hMPCs的干性有关，包括细胞分裂、软骨发育和染色体分离（图1G）。重叠每个重复中排名靠前的基因后，他们发现了多个已知参与细胞衰老的基因（图 1H、S1J 和 S1K），包括编码在细胞衰老过程中降解的组蛋白H4（小编注：蛋白精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）是产生单甲基精氨酸和不对称二甲基精氨酸的主要酶。PRMT1介导的组蛋白H4在精氨酸3（H4R3me2as）上的不对称去甲基化能够维持H4的稳定性。但在衰老过程中，H4R3me2as水平下降，进而导致蛋白酶体激活因子PA200与组蛋白H4之间的相互作用增强，最终催化组蛋白H4的非泛素化降解。组蛋白H4是核小体的核心组分，参与了转录调控、DNA修复、DNA复制和染色体稳定性。衰老引发的H4降解会导致核小体分解，进而细胞周期抑制因子基因、SASP相关基因和抗凋亡基因的启动子处的核小体占有率降低，故而RNA聚合酶更容易起始上述促衰老基因的转录）的H4C6、编码组蛋白甲基转移酶的SETD1A、编码GARP复合物成分的VPS54、编码类似伴侣蛋白的LGSN，以及炎症反应抑制剂，如 MARCHF845 和SPTBN1。为了证实筛选数据的准确性，他们验证了两个重复中富集的前九个基因（SOX5、H4C6、EDNRA、SLC22A7、SETD1A、C9orf50、PIK3R5、ZC3H14 和 NTF3）（图 1H）。从sgRNA转导后SA-β-gal阳性细胞的比例可以看出，激活前九个候选基因中都能延缓WS hMPCs的细胞衰老（图 1I）。在这些基因中，SOX5、H4C6和C9orf50的促再生效果最为明显，与最近发现的抗衰老因子SETD1A的作用相当。在随后的研究中，他们选择了SOX5作为研究对象，因为它是一种转录因子，具有重构转录网络的潜力。值得注意的是，SOX5从未被认为是衰老调节基因。

图1 CRISPRa筛选发现WS hMPC更新再生基因

图S1 全基因组CRISPRa筛选发现SOX5可减轻WS hMPCs细胞的衰老

2 SOX5上调对衰老hMPCs具有抗衰老作用

转录因子SOX5属于SRY盒（SOX）基因家族成员，在中胚层分化和发育过程中起着至关重要的作用。研究人员发现，与野生型（WT）hMPCs相比，WS hMPCs中SOX5的mRNA和蛋白水平都有所降低（图2A和2B）。为了进一步确定SOX5与衰老之间的关系，他们首先在Aging Atlas的数据库中检索SOX5，发现SOX5的含量确实在一系列衰老细胞（如WS hMPCs和紫外线[UV]处理的内皮细胞）和组织（如早衰猴的皮肤和肝脏）中下降、而在使用已知老年保护因子（如维生素 C）处理过的年轻细胞或组织中，SOX5的含量高于其在年老的细胞或组织中的水平（图 S1L）。这些结果表明，SOX5的丰度与年龄呈负相关，这与CRISPRa筛选所强调的其促再生的潜力是一致的。接下来，研究人员利用CRISPRa促进SOX5在WS hMPCs中的表达（图2C和2D）。SOX5的激活改善了 WS hMPCs的增殖潜力，提高了Ki67阳性细胞的比例（图 2E 和 2F）。SOX5表达的升高缓解了多种早衰表型，表现为 SA-β-gal 活性降低（图 2G）、衰老标志物P16和P21表达降低，以及核形态恢复，核纤层蛋白B1和层状相关多肽2（LAP2）水平升高（图 2H-2J 和 S1M）。

此外，SOX5 的上调还能改善基因组稳定性，这体现在人类内源性逆转录病毒K型（小编注：内源性逆转录病毒（ERVs）可以与宿主基因组插入突变中启动子等调控元件相互作用，进而影响这些基因的转录活性，同时它还能通过诱导基因组重排和插入突变来影响基因组稳定性。在年轻细胞中，ERV的转录被抑制，进而基因组维持稳定。然而细胞衰老后，ERV的转录抑制被解除，进而导致基因突变）的转录被抑制（图2K）和DNA损伤位点（由磷酸化 H2A.X [γH2A.X] 和 53BP1 标记）减少（图 2L）。此外，激活SOX5还可减少衰老相关分泌表型（SASP，细胞衰老的标志性特征）相关基因的表达（如白细胞介素IL-6）（图 2H）。CRISPRa介导的SOX5激活对衰老相关的转录组特征进行了重新编程，这与衰老的表型逆转是一致的。研究人员观察到SOX5激活引起的差异表达基因（DEGs）中，与细胞增殖和细胞分裂相关的基因上调，与炎症反应相关的基因下调（图 S1N-S1P）。因此，这些研究结果表明，SOX5是一种有效的抗衰老因子，可减缓人类干细胞的衰老。

为了验证这一观点，研究人员进一步测试了通过cDNA转基因来异位表达SOX5是否也能缓解细胞衰老。同样，正如基于CRISPRa的检测方法所观察到的那样，过量表达SOX5减轻了WS hMPCs的所有衰老表型（图S2A-S2M），并促进了年轻相关的转录程序，其中五分之一（6307个DEGs中的1038个）的DEGs在WS hMPCs中被逆转（图2M、2N和S2N）。此外，过表达SOX5 的再生细胞保留了经典的hMPCs标记（图 S2O），并显示出更强的软骨生成、脂肪生成和成骨能力（图 2O-2Q）。此外，SOX5还能减少移植在免疫缺陷小鼠胫骨前肌（TA）中的WS hMPCs的消耗（图2R）。为了排除SOX5过表达的潜在致癌作用，研究人员进行了一项长期植入试验，监测期长达15个月，未观察到任何肿瘤形成（图S2P）。总之，这些结果证实了SOX5能保护hMPCs免于过早衰老。

图2 WS hMPCs中SOX5的激活可减轻细胞衰老

图S2 异位过表达SOX5可缓解WS hMPCs的衰老

3 SOX5在多种衰老细胞模型中具有再生能力

接下来，研究人员试图研究除了改善WS hMPCs的衰老外，SOX5的激活是否还能缓解其他类型的细胞衰老。为此，他们检测了SOX5在复制性衰老（RS）和哈奇森-吉尔福德早衰综合征（HGPS）hMPC模型中的表达，后者携带导致衰老相关疾病的LMNA基因G608G突变形式。结果表明SOX5在RS和HGPS hMPC中下调（图S3A）。然后，他们异位表达了SOX5，并观察到这些细胞模型的衰老表型，如克隆扩增能力受损、Ki67阳性细胞比例下降、SA-β-gal阳性细胞增多、细胞衰老标志蛋白表达升高等，都被SOX5的过表达所改善（图 S3B-S3L）。特别是，SOX5过表达后，由LMNA基因G608G突变形式编码的早衰素的表达量减少了（图S3M）。此外，他们还评估了SOX5在不同应激诱导的细胞衰老模型中的再生作用：H2O2诱导氧化应激、紫外线照射诱导DNA损伤应激和癌基因（H-RasV12）过表达。在所有模型中，都观察到了SOX5表达量的降低（图 S4A-S4C）。同样，SOX5的过表达恢复了受损的增殖能力（图 S4D-S4I），并减少了SA-β-gal阳性细胞的数量（图 S4J-S4L）。此外，SOX5的激活还缓解了健康老年人的原代hMPCs和人真皮成纤维细胞（图 S4M 和 S4N）以及人肺动脉内皮细胞（HPAECs）的衰老（小编注：作者检测的细胞都是中胚层发育来的。人体四大类组织分别是——来源于中胚层的肌肉组织、结缔组织，来源于外胚层的神经组织，和来源于外胚层、内胚层的上皮组织。间充质干细胞不仅仅可以分化为同胚层来源的各种细胞，组成肌肉组织、结缔组织，还可以跨胚层分化为其它细胞，组成神经组织、上皮组织等。真皮成纤维细胞起源于胚胎中胚层间质细胞，是构成体内疏松结缔组织的主要细胞。近年来研究发现，真皮成纤维细胞也能够表达间充质干细胞相关标志物，具有多向分化潜能，在特定条件下能够向骨、脂肪、软骨、肌腱、神经以及胰岛等多胚层组织器官分化。许多伴有复杂慢性合并症的老年患者患有肺动脉高压，肺血管疾病内皮细胞衰老是肺动脉高压的内皮功能障碍的潜在统一特征。所以作者在选择组织类型时，可能参考了细胞分化潜能特性和衰老相关疾病特征），而不会改变它们的细胞特性（图 S4O 和 S4P），这表明SOX5在不同的生物环境中都能缓解衰老。

图S3 SOX5恢复RS和HGPS hMPCs的更新再生能力

图S4 SOX5减轻由不同应激源诱导的细胞衰老

4 SOX5 的缺失会导致年轻的 hMPC 细胞衰老

SOX5的上调对hMPC的衰老有保护作用，于是研究人员想知道SOX5的缺失是否会产生相反的影响。为此，他们通过转染小干扰 RNA（siRNA）到早期 WT hMPCs（年轻 hMPCs）中来沉默 SOX5 的表达（图3A-3B）。与预期一致，敲除SOX5细胞出现了典型的衰老特征，如降低的增殖能力（克隆生长受到影响，Ki67 阳性细胞比例下降，S期细胞比例降低），加深的SA-β-gal染色程度，以及核形态变大（图3C-3G）。与加速衰老表型相一致的是，SOX5基因敲除也诱导了衰老标记基因的表达，包括CDK抑制剂（CDKN2A 和CDKN1A）、SASP基因（IL-6）（图3H和3I）、增加的DNA损伤反应以及HERVK转录水平的升高（gag和pol）（图3K）。同样，核纤层相关基因（LMNB1和TMPO）在SOX5基因敲除的细胞中也减少了（图3H、3I和3L）。研究人员还评估了转录组图谱，发现SOX5下调会导致与细胞增殖相关的基因明显减少，这与SOX5在WS hMPCs中过表达所诱导的主要转录过程相反（图3M和3N）。研究人员利用CRISPRa相同的sgRNA介导CRISPRi，抑制了SOX5的转录，并表征了在 SOX5 缺乏的细胞中观察到的 hMPC 加速衰老（图3O-3R）。这些结果证实了SOX5作为人类干细胞衰老负调控因子的作用。

图3 SOX5敲除年轻hMPCs细胞衰老

5 SOX5重塑WS hMPC的表观遗传和转录组程序

接下来，研究人员研究了SOX5介导的hMPC重新活化的机制，因为SOX5是一个转录因子，所以研究人员研究了SOX5是否以DNA结合依赖的方式使衰老的细胞重新活化。研究人员构建了DNA结合活性受损的SOX5的突变体（SOX5N561H和SOX5R571W是两种突变体，其与HMG的结合域被破坏）（图4A），研究人员观察到这两种突变体的异位表达不能像SOX5WT那样改善WS hMPCs的衰老，表明SOX5通过其转位活性来改善衰老（图4B和4C）。因此，研究人员利用ChIP-seq实验评估了SOX5与基因组的结合位点（图S5A-S5C），共有59963种结合事件，当过表达SOX5时，其中大多数（50831，84.77%）存在peaks，即SOX5能与DNA结合（图4D）。与之前的报告一致，在WS hMPCs中，SOX5的很大比例峰值映射到了基因间区和内含子区（图S5A），这些区域可能存在调控元件。事实上，确实有超过75%的SOX5结合位点在距离TSSs 超过3kb远的基因组区域（图4E）。研究人员推测这些远端 SOX5 结合位点是具有转录激活作用的潜在增强子区域。

研究人员采用多种策略进一步探索了这些结合位点的表观遗传学特征，如H3K27ac和H3K4me1（增强子标记物）ChIP-seq（图S5D-S5I）、H3K4me3 （活性启动子标记物）ChIP-seq（图S5J-S5L）、转座酶可及染色质高通量测序（ATAC-seq）分析（该方法用于评估活化状态和染色质可及性）（图S5M-S5O）（小编注：在这里，作者通过ChIP-seq鉴定组蛋白修饰标记的H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3在基因组的富集情况，以确定可能的增强子和启动子活性位点，然后通过结合ATAC-seq增加所获得增强子和启动子的准确性，缩小待研究的序列的范围）。有趣的是，大多数的SOX5结合位点都映射到了以H3K27ac和H3K4me1为标志物的活性增强子区域，其中还有一些在以H3Kme3为标志物的区域（图4F和S5P）。在全基因组水平上，研究人员观察到了SOX5和H3K27ac、SOX5和H3K4me1 ChIP-seq信号之间具有相关性（图4G、图S5P和S5Q）。研究人员评估了 SOX5 激活导致的 H3K27ac、H3K4me3、H3K4me1 和 ATAC 信号的整体变化。具体而言，研究人员发现随着 SOX5 的激活，ATAC和H3K27ac 峰增加，所有 ATAC 和 H3K27ac 峰的平均信号也随之增加（图S5R和S5S）。特别的是，在SOX5 结合的位点，H3K27ac 和 ATAC 峰的平均信号增强更强。在获得的 SOX5 结合位点中，90%以上是由 H3K27ac和H3K4me1共同修饰的活性增强子，只有 4.6% 是仅含有H3K4me1的非活性增强子区域（图4H和4I）。同样，SOX5 的过表达导致 与SOX5 结合的增强子周围的增强子标志物（H3K27ac 和 H3K4me1）修饰增加（图4J-4K、图S5U和S5V）。他们也发现了SOX5 的异位表达导致与SOX5结合的增强子周围的ATAC-seq信号增强（图4L-4N）。因此，研究人员发现，参与有丝分裂细胞周期（如BUB1，编码一种调节纺锤体检查点的激酶）、软骨发育（如COL11A1，编码 XI 型胶原蛋白）和干细胞增殖的基因（HMGB2，DNA结合蛋白，参与染色质重塑和转录）在 SOX5 与其增强子结合后被激活（图4O-4P），这表明SOX5的过表达会导致 SOX5 结合位点/增强子容纳性增强。

组蛋白修饰

常见组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等，近些年也发现了一些新型修饰，比如乳酸化、巴豆酰化等。组蛋白乙酰化主要通过中和赖氨酸的正电荷，这被认为可以破坏尾部和带负电荷的核小体DNA之间的相互作用,从而促使核小体松散，促进染色质的打开，进而促使转录发生。乙酰化通常与转录激活有关，去乙酰化则与转录抑制相关。而组蛋白甲基化通常发生在N端精氨酸与赖氨酸残基上，可发生单甲基化、二甲基化或三甲基化，也与基因的转录激活和抑制相关。

活性增强子上常有H3K4me1和H3K27ac的共定位，当只有H3K4me1，没有H3K27ac（有些有H3K27me3）的增强子则是沉默态或平衡态。反之，当增强子区域同时富集H3K4me1和H3K27ac修饰时，该增强子就处于激活状态促进基因表达。

H3K4me3可作为启动子标志。研究表明，H3K4me3主要富集在转录起始位点附近的启动子区域，通过与转录起始和延伸的蛋白相互作用来促进转录。此外，H3K4me3还能与生长抑制因子1（ING1）相互作用，进而介导DNA损伤修复。

参考文献

[1] Musselman CA, Lalonde ME, Côté J, Kutateladz TG. Nat Struct Mol Biol 2012; 19: 1218–1227.  

[2] Creyghton, M.P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 21931–21936 (2010).

此外，研究人员还进行了高通量染色体构象捕获（Hi-C）实验，以研究过表达 SOX5 的 WS hMPC 的三维基因组拓扑结构（图S6A）。关于A/B区室，研究结果表明，虽然A/B区室总体上保持不变，但过表达SOX5会导致活性A区室减少，同时抑制性B区室略有增加（图S6B和S6C）。这一观察结果与异染色质状态的恢复一致（图S6D-S6G），与WS hMPCs 老化过程中观察到的区室变化方向形成对比。这些结果表明，SOX5 部分重组了衰老过程中失调的高阶染色质结构。

为了进一步确定SOX5是否参与了启动子-增强子（P-E）相互作用，研究人员利用基于Hi-C的染色质环路分析发现，在WS hMPC中，有3/5（1,240/2,004）个P-E环路被SOX5锚定（图S6H）。他们发现，SOX5的结合位点与增强的P-E环相互作用和新建立的P-E环有关（图4Q、4R和S6I）。被SOX5占据并修饰有高水平活性增强子标志物H3K27ac和ATAC信号的 P-E 环表现出更高的相互作用强度，并伴随着目标基因表达上调的趋势，因此被归类为 SOX5 驱动基因（图4S和S6J）。其中，上调的SOX5驱动基因富集于细胞迁移、胶原纤维组织和细胞周期通路（图4T）。这些观察结果表明，SOX5促进了基因调控网络的重塑，而基因调控网络是衰老干细胞年轻化的基础。

图4 SOX5 将与年龄相关的表观遗传学和转录组程序重编程为年轻状态

图S5 具有SOX5过表达的WS hMPCs的表观基因组分析

图S6 SOX5重塑染色质结构并在恢复活力过程中调节HMGB2

6 SOX5反式激活 HMGB2 增强子

为了探索介导SOX5重新活化的潜在效应因子，研究人员鉴定了严格符合以下标准的基因：(1)通过SOX5 ChIP-seq 鉴定出的SOX5靶向基因，并携带SOX5结合信号；(2)在WS hMPCs 中过表达SOX5后，H3K27ac和H3K4me1 以及其增强子区域周围的 ATAC-seq 信号升高的基因；(3)与WT hMPCs 相比，在 WS hMPCs 中受到抑制，但在SOX5过表达后得到挽救的基因；(4) 在WT hMPCs 中敲除 SOX5 后出现下调的基因（图5A和5B）。通过这一策略，探究人员发现7个严格符合上述标准的基因（图 5C）。其中，HMGB2 是细胞增殖的正向调节因子，随着衰老而减少（图5D-5F和S6K-S6T）。

研究人员随后进行了一系列实验，以验证HMGB2是否受SOX5的转录调控。ChIP-qPCR 证实，SOX5 在HMGB2上游10 kb处结合，并伴随着H3K27ac 和H3K4me1的富集（图5G），研究人员将这一区域定义为HMGB2的增强子（E-HMGB2）。此外，他们还将E-HMGB2序列克隆到荧光素酶报告质粒（pGL3-promoter载体）中，以评估其增强子活性。E-HMGB2本身显示出荧光素酶信号的增加（图5H），表明其内在增强子活性。SOX5与荧光素酶报告质粒的共表达将其增强子活性进一步提升至5倍，而SOX5N561H和SOX5R571W突变体则消除了这种活性（图5I）。研究人员还观察到，SOX5的突变削弱了SOX5对HMGB2 转录本表达的积极作用（图5J和5K）。这些结果表明，SOX5是通过与HMGB2的增强子结合来激活其转录的。

图5 SOX结合并调节HMGB的增强子

7 SOX5-HMGB2通路抵抗衰老

为了进一步探究HMGB2在hMPC衰老中的作用，研究人员利用CRISPR技术在早期WT hMPC（年轻hMPCs）中敲除了HMGB2基因。敲除HMGB2可以模拟SOX5缺乏的表型，年轻的hMPCs中出现了典型的衰老特征，如受损的增殖能力、增加的SA-β-gal阳性细胞比例以及衰老标志物的表达（P16、P21）（图6A-6D）。相反，过表达HMGB2减少了SA-β-gal的阳性细胞数量、改善了WS hMPCs的增殖能力（图6E-6H），这与SOX5过表达效果类似。然而，由于敲除了HMGB2，所以过表达SOX5并不能改善细胞早衰（图6I-6L）。这些数据表明，HMGB2是SOX5的抗衰老作用的重要下游介导因子。

图6 HMGB2作用于SOX5下游抵抗衰老

8 基于SOX5过表达的基因疗法可缓解小鼠与衰老相关的关节退行性病变

骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾病，其特点是软骨细胞损伤和丢失导致软骨退化。软骨细胞通过表达细胞外基质来维持软骨的弹性，但随着年龄的增长，软骨细胞会逐渐衰老和丢失。因此，软骨会发生磨损，导致软骨下骨暴露、滑膜增生以及软骨边缘和韧带处的骨质增生。

研究人员发现，与年轻小鼠（2月龄）相比，老龄小鼠（18月龄）的 SOX5 和HMGB2阳性关节软骨细胞的百分比均有所下降（图7A-7C，图S7A）。同时，在老化关节中他们还观察到软骨面积减少、骨质增生形成和滑膜增生(图7A、S7B 和S7C）。此外，老化软骨显示出更多的衰老细胞，表现为P21或小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV，一种与HERVK相关的小鼠ERV）染色阳性细胞数量增加，以及Ki67阳性细胞数量减少（小编注:衰老细胞中的ERV反转录产物通过激活cGAS-STING天然免疫信号通路诱发细胞炎症和衰老，此外衰老细胞释放的ERV病毒颗粒可通过旁分泌的方式或液体介导的方式在器官、组织、细胞间有效传递并放大衰老信号，最终使得年轻细胞因受“感染”而老化）（图S7D）。他们还观察到蛋白聚糖的下调（图 S7D）。这些结果表明，老龄小鼠的OA病变在表型和分子水平上都存在关节退化。

ERV在衰老过程中的作用

内源性逆转录病毒（Endogenous Retrovirus，ERV）起源于整合的外源性逆转录病毒，并在进化过程中成为宿主基因的一部分（约占人类基因组的8%）。大部分ERV在进化过程中失去了编码产生病毒颗粒的能力，但一些ERV，如HERVK，在进化上相对年轻，所以保留了产生病毒颗粒所需的基因。ERV受到健康宿主的严格控制以维持宿主自身的基因组稳定性，但是在衰老细胞中，ERV可以被重新激活。

在年轻的细胞中，ERV被H3K9me3和DNA中5′甲基胞嘧啶（5mC）的甲基化所抑制，但在衰老过程中，DNA的甲基化水平降低，此时ERV得以被转录，其转录后的RNA可与病毒蛋白一起包装成RVLP（retrovirus-like particles，类逆转录病毒颗粒），RVLP会感染年轻细胞，进而使其衰老；ERV RNA也可以逆转录成ERV DNA，cGAS-STING信号通路可以识别ERV DNA并诱导先天免疫反应和SASP因子，促进细胞衰老。

参考文献

[1] Sha Zhou et al. Life Medicin. Volume 2, Issue 1, February 2023, lnad001.

[2] Liu X et al. Cell. 2023 Jan 19.

基于这些观察结果，研究人员想知道SOX5的过表达是否能使关节软骨恢复到年轻状态。于是他们在老龄小鼠的关节内注射了表达SOX5或HMGB2的慢病毒，并以标准年轻化因子OSKM作为阳性对照（图7D）。通过免疫组化染色或逆转录酶定量 PCR（RT-qPCR）评估慢病毒注射的效率（图S7-7F）。在注射慢病毒8周后，研究人员对番红和固绿（SO&FG）以及苏木精和伊红（H&E）染色的膝关节切片进行了显微 CT 扫描和组织形态学分析，以评估关节再生情况。正如预期的那样，与感染表达GAL4的慢病毒的对照组小鼠相比，用表达SOX5、HMGB2或OSKM的慢病毒处理的小鼠（简称为SOX5、HMGB2或 OSKM-小鼠）可减轻衰老引起的 OA 病变，表现为软骨厚度明显增加、骨质增生和滑膜增生减少以及握力增强（图7E-7G和图S7G-7H）。在分子水平上SOX5、HMGB2或OSKM的表达可显著降低关节软骨中衰老基因（P21 和 MMTV）和炎症基因（IL-6 和肿瘤坏死因子α [TNF-α]）的表达（图7H-7K和S7I-S7K）。值得注意的是，软骨的功能衰退也得到了改善，这体现在蛋白聚糖的表达增加和基质金属蛋白酶-13（MMP13）的表达减少（图7L、7M、S7J和S7L）。

此外，因前交叉韧带横断（ACLT）手术（小编注：这是一种常用的骨关节炎造模方法，该方法主要通过打破关节稳定性诱导软骨退变，具体操作方法为将小鼠的膝关节侧面横向切开皮肤，打开关节囊后用手术刀切开小鼠前交叉韧带，这种方法具有操作简单、结构破坏小的优点）引起的OA病变在SOX5、HMGB2-或OSKM-小鼠中也有所减轻（图S7M-S7Q）。考虑到 OA 的性别差异，研究人员验证了SOX5对两性的老年小鼠保护作用，尽管其作用程度可能不同（图S7R）。综上所述，这些结果表明，在关节软骨中靶向表达SOX5可减轻与年龄相关的关节退化和关节软骨的逐渐丧失，其效果与OSKM观察到的效果相当。

图7 关节内注射表达SOX5、HMGB2或OSKM的慢病毒可减轻小鼠衰老引起的OA损伤

图S7 关节内注射表达SOX5、HMGB2或OSKM的慢病毒减轻衰老或ACLT引起的小鼠OA损伤

总结 

目前，我们对细胞衰老的分子基础仍知之甚少，这限制了通过防止干细胞衰老来改善与年龄有关的病症的疗法发展。本文中，研究人员利用类早衰综合征的人类间充质前体细胞（hMPC）模型进行了全基因组CRISPR激活（CRISPRa）筛选。研究人员评估了激活后能拮抗细胞衰老的靶点，其中SOX5的表现最为突出。通过解码过表达SOX5所重塑的表观基因组，研究人员发现了 SOX5 在重置包括 HMGB2 在内的老年保护基因转录网络中的作用。在机制上，SOX5的结合提高HMGB2的增强子活性，增加了H3K27ac和H3K4me1的水平，从而提高了HMGB2的表达，促进了细胞恢复“年轻”。此外，用携带 SOX5 或 HMGB2 的慢病毒进行基因治疗可使软骨恢复活力，缓解老年小鼠的骨关节炎，说明了SOX5是体外和体内抗衰老的有效驱动因子。

原文链接：https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(23)00328-4