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狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会报告(4) 体外抗原定量检测
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人用和兽用狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会报告
4. 取代动物使用的替代方案：体外抗原定量检测
4.1 科学现状
近年来，已经开发了许多参照一个合适的参考标准品在体外定量检测疫苗中的狂犬病毒抗原的方法。研讨会与会者回顾了这些分析并且讨论了每一种方法的验证和在全球范围内实施的机遇和挑战。
狂犬病毒刺突糖蛋白（G 蛋白）是主要的狂犬病毒抗原，在动物中显示出可诱导狂犬病毒中和抗体。狂犬病毒G蛋白的天然折叠形式是与病毒颗粒相联的三聚体形式且有高度的免疫原性。因此，能将糖蛋白含量等价于疫苗效力的任何体外试验和相关的检测用单克隆抗体，必须能够区分出两种构型的G蛋白：高免疫原性、与病毒颗粒相联的三聚体和低免疫原性、不与病毒颗粒相联或可溶的单体。建立抗原数量和质量与其免疫原性和保护性应答之间的直接关联，是一个重大和持久的问题。此外，当把含有佐剂的狂犬病疫苗效力测试包括在内时，这一障碍意味着更大的挑战。迄今为止，使用单克隆抗体（国家兽医分析实验室，NVAL单克隆抗体 ）给三聚体形式的G蛋白抗原定量的ELISA， 仅在日本用于无佐剂兽用狂犬病疫苗生产和检测的批签发效力实验(Koichiro Gamoh，NVAL（日本）。
Claudia Lopez-Yomayuza博士（Justus Liebig大学，德国）总结了可用的替代狂犬病疫苗效力检测的体外实验方法的开发，其中包括：疫苗的基因组学和蛋白质组学鉴定，抗原/免疫原含量的测量，抗原结构和病毒颗粒的完整性评估。需要注意的是G蛋白质量不与免疫原性或效力直接相关。因此，G蛋白ELISA需要中和性单克隆抗体，该抗体能正确地确定存在于疫苗批中的相关抗原（与病毒颗粒相关联的三聚体）的数量。Lopez-Yomayuza 建议，提议中的体外实验应与针对目标物种的血清学试验相关联。
研讨会期间考虑了三种用于确定灭活狂犬病疫苗效力的体外替代实验类型：酶联免疫吸附试验（ELISA）、单向辐射免疫扩散试验（SRID）和抗体结合试验（ABT）。
4.1.1．酶联免疫吸附试验（ELISA）
免疫捕获ELISA（IC-ELISA）使用抗糖蛋白抗体（单克隆或多克隆）包被的的微量滴定板捕获疫苗或生产过程中所取样品中的抗原。使用G蛋白三聚体构象特异性单克隆抗体检测结合的抗原，从而仅定量构象正确的抗原。
Koichiro Gamoh博士（NVAL，日本）提供了一个IC-ELISA的综述和详细的步骤，自1996年以来该方法在日本已被批准用于无佐剂兽用狂犬病疫苗的批签发效力实验。这种替代方法在进行ELISA之前通过凝胶过滤除去水溶性单体G蛋白。使用的单克隆抗体（单克隆抗体13-10）与天然的三聚体糖蛋白结合，而不与可溶性单体G蛋白结合。正如Gamoh 强调，日本还没有要将此ELISA法应用到人用狂犬病疫苗批签发效力实验的打算。
据Jean-Michel Chapsal博士（赛诺菲巴斯德，法国）介绍，目前法国国家药品安全局（其前身为法国健康产品医疗安全局（AFSSAPS）基于一种D1单克隆抗体用夹心ELISA法捕获和检测抗原。D1单克隆抗体与三聚体G蛋白而不与可溶性单体G蛋白起反应。目前在法国ELISA用于无佐剂人用狂犬病疫苗中G蛋白的定量。与狂犬病疫苗效力相关的一个主要方面是对跨膜G蛋白的中和抗体的诱导，免疫原性是取决于其保留的三维立体结构。因此Chapsal表示，在疫苗的开发过程中物理化学测试，其中包括微量量热法、表面等离子体共振、和动态光散射，可以用于了解一种疫苗的特征，特别是为了确保G蛋白保持正确的折叠结构。Chapsal也报告了用某种抗体包被和D1单克隆抗体检测的一种夹心ELISA的研发。滴定法用于针对第6届世卫组织狂犬病疫苗内部标准IU进行内部基准的校准。最后，Chapsal说，抗原定量可能代表了NIH实验的一个合适的替代，只要疫苗经过了充分的鉴定，而且制造工艺流程保持严格的一致性。
Fabrizio de Mattia博士（MSD 动物健康，荷兰）描述了柠檬酸钠处理磷酸铝佐剂兽用疫苗，用以吸附狂犬病毒抗原，然后用双抗体夹心ELISA进行定量的验证研究。测试结果表明，柠檬酸钠处理并没有改变G蛋白的抗原表位，在疫苗的抗原含量不同的情况下，检测结果均呈线性关系，并且这项技术可以区分高效力和低效力批次。
4.1.2. 单向辐射免疫扩散试验（SRID）
Lorraine McElhinney 博士（AHVLA，英国）讨论了SRID实验与NIH实验的弱相关性，该实验也不能用于佐剂疫苗。发现用SRID实验检测疫苗效力值持续偏高，因为它不能区分与病毒颗粒相联的具有高度免疫原性的G蛋白病毒颗粒与其免疫原性差的单体形式。此外，采用小鼠攻击实验证明不合格的过期人用疫苗批（<2.5 IU /毫升），在用SRID法检测时却能被证明合格。最后，Lyng等1992年也证明，在稳定性研究中SRID结果与小鼠攻击实验相关性较差。因此，没有提出SRID为成品疫苗效力试验的替代品，虽然它可能会被考虑用于过程中监测以估计总的病毒蛋白。Gairola报告说，他们利用一个改良的七天SRID作为一个半成品疫苗的过程中监控。
4.1.3．抗体结合试验（ABT）
ABT 是通过连续稀释的参考品或测试疫苗批与标准化的多克隆中和抗血清孵育，并使用一种荧光灶反应检测未被吸收（中和）的抗体。正如McElhinney博士所说，即使ABT可能比小鼠攻击试验有优势，它与体内试验的相关性相当差。此外，尚无数据可证明ABT能区分天然的三聚体的G蛋白与免疫原性差的G蛋白，并且已知道佐剂的存在会抑制抗体结合从而干扰此检定。由于存在这些问题，加之已有IC-捕获ELISA检测的开发，不推荐进一步开发ABT。
Gairola博士总结了一个制造商的观点：为在狂犬病疫苗效力试验中避免使用动物，应实施和使用一致性参数和整合的方法。疫苗批签发一致性方法模式的目的是：1）确定用非动物试验可以准确检测的安全性和有效性的关键指征，从而避免在进行成品批签发检定时使用动物；2）在整个生产过程中使用质量控制程序，一旦产品一致性的关键参数有不可接受的变化，应能及时发现; 3）鼓励将更新的概念（例如，质量源于设计（QBD），过程分析技术（PAT）方法）用于疫苗质量保证(QA)。确定狂犬病疫苗效力和安全性的一致性的成功方法，将需要若干次过程中的检测以准确地确定相关狂犬病毒G蛋白的数量和完整性。这些方法可能包括2-D凝胶电泳和核蛋白的ELISA测定法，可以确定结构完整（核蛋白未能检出）的与降解的病毒颗粒（检测到释放的核蛋白）的比例。监管当局支持常规的狂犬病疫苗批签发的生产一致性参数和/或综合质量控制策略的开发和验证。
4.2. 研讨会讨论
研讨会与会者们同意，在ELISA中使用的单克隆抗体似乎是用于测量病毒相关的构象完整的糖蛋白最好的定量方法。如果可溶性G蛋白的存在会干扰免疫相关蛋白的检测，它应该被移除或被封闭（或两者都包括）。需要确定针对构象正确的G蛋白的特异性单克隆抗体与每种特定的狂犬病疫苗的保护作用的相关性。
研讨会与会者们建议，为了发展和推进狂犬病疫苗替代性体外效力检测方法，一张能标明特异性针对天然狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体的亲和力、特性、来源和可用性的列表将是一个宝贵资源。然而，由于知识产权和注册许可方面的问题，并非所有可能有用的单克隆抗体都可用于检测方法的开发或商业治疗。研讨会与会者指出，由于狂犬病疫苗的生产来自于不同的病毒株，一种单克隆抗体可能无法适用于所有产品。
包括标准参考品在内的试剂的持续可用性是进行ELISA验证的关键。目前，EDQM和WHO狂犬病标准品都是无佐剂的，但已经与加佐剂的产品进行过比较。研讨会的与会者表示，ELISA检测法的成功开发将需要内部标准品（例如，用国际狂犬病疫苗标准品之一校准过效力的一批内部疫苗）。
研讨会与会者建议，为了使任何替代方法能成功实施并得到监管部门的批准，有必要通过使用低效力批疫苗来确定该替代方法与小鼠攻击实验能否通过之间的相关性。支持与小鼠实验结果相关联的数据，可能需要对合格的疫苗批用洗涤剂、改变pH，热处理或其他可接受的方法进行处理，来生成低效力批。，还可能需要对据认为是对人类或动物具有保护作用的血清学滴度进行比较。此外，研讨会的部分与会者建议，最低限度，在体外抗原定量效力试验实施后的规定期限，应考虑进行主动的上市后监测，以确认疫苗产生了适当的中和反应。
研讨会与会者不鼓励进一步发展ABT或SRID检测作为效力实验的替代实验，因为与小鼠攻击试验的相关性较差，并不能区分具有高免疫原性的与病毒颗粒相联的G蛋白与免疫原性较弱的单体G蛋白。 然而，研讨会与会者确实都同意，SRID分析用于在过程中检测G蛋白总量可能是有用的。
4.3．建议
l 狂犬病疫苗的效力取决于与病毒相联、构象完整的G蛋白，用能识别这样的G蛋白的单克隆抗体建立的ELISA方法看来是狂犬病疫苗效力最好的定量方法。如果可溶性的G蛋白的存在会干扰免疫相关蛋白的检测，它应该被移除或被封闭（或两者都包括）。需要确定构象正确的G蛋白特异性单克隆抗体与每个具体的狂犬病疫苗的保护作用之间的相关性。
l 鼓励生产商开发、验证和实施体外抗原定量方法，以取代小鼠攻击测试。对于无佐剂和单价的人用狂犬病疫苗（如在美国和欧盟所用的），应该优先发展体外效力试验。
l 用于成品的体外方法将需要鉴定和使用恰当的试剂（例如，单克隆抗体），这些试剂具有针对与病毒相联的三聚体形式G蛋白的中和表位的特异性。
l 体外替代试验的验证需要包括低效力批的识别。体外实验结果与血清学滴度的比较可能也是必要的。
l 狂犬病疫苗生产商目前在生产过程中使用的体外抗原定量方法包括ELISA和SRID。然而，SRID并不适用于鉴定保护性免疫所必需的特异性三聚体G蛋白。
l 实施无佐剂疫苗体外检定方法，应考虑下列准则：
2 及早并经常与监管部门沟通
2 定义试剂，包括内部病毒株有关的参考品和二级标准品
2 生成下列高质量的数据：
- 证明单克隆抗体针对保护性的具构象表位的特异性
- 证明区别合格和不合格批的能力
- 比较ELISA和小鼠攻击实验
- 最好能显示定性的而不是统计意义的相关性
2 比较小鼠或宿主动物的SNT数据
2 生成过程中的数据，以证明生产一致性
2 和监管机构一起审查数据，以确保试剂和恰当验证的相关性
2 在这个过程中尽早与国际组织协调
l 在采用佐剂疫苗体外检测方法时，考虑应用下列准则：
制造商除考虑以上所列步骤，还应考虑下列步骤：
n 开发去除佐剂的方法：
- 开发的数据应能确认，除去佐剂不干扰单克隆抗体检测免疫原性G蛋白。
n 开发直接测试佐剂疫苗的方法：
- 确定被组装到成品中的G蛋白抗原的质量和数量。
n 考虑使用有佐剂的参考标准品，克服无佐剂的参考标准品和佐剂疫苗之间无平行性的问题。
n [ Biologicals (2012), http://dx.doi.org/10.1016/j.biologicals.2012.07.005 邱 松译 严家新校 ]
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