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狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会报告(3) 小鼠血清抗体中和试验
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人用和兽用狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会报告：
3. 优化和减少方案: 血清效力测定 - 抗体定量方法
3.1. 科学现状
血清效价方法是测定接种过疫苗的动物所产生抗体的数量，再与原始攻击模型中已知可提供保护作用的参考抗体的效价进行比较。血清学方法避免了IC注入活狂犬病毒及其相关的不可缓解的疼痛和痛苦，同时可避免未受保护的免疫接种动物和对照组动物出现临床疾病，可显著减少小鼠狂犬病攻击实验。
Lukas Bruckner博士（IVI，瑞士）提供了一个综述，概述了改良的快速荧光灶抑制试验（RFFIT，现在被称为血清中和试验，简称SNT））用于兽用狂犬病灭活疫苗的效力实验的国际合作研究的历史和现状。欧洲药品和医疗保健质量管理局（EDQM）赞助一个由10国13个实验室进行的国际合作研究，包括欧盟、加拿大和美国的实验室，旨在确认SNT的准确性和实验室间的可转移性。 SNT能够区分出在当前的攻击实验中已经确定的低效力批。血清学检测，虽然不能完全消除动物的使用，确实符合3Rs目标：对每个试验疫苗可高达10倍（8-10与 ～80）地减少动物的使用量，避免IC攻击方法的痛苦和疼痛。与攻击实验相比，SNT也有更好的时间效益比（3周对大于4周）。 2011年，欧洲药典专家组15次会议建议将SNT检测纳入修订的欧洲药典专论0451。研讨会与会者一致认为，该专论提供了一个重要的框架，可以由工业界用以进行为实施SNT所必需的产品特异性验证。研讨会以后，欧洲药典委员会在2012年4月批准了修订的该专论。
Elisabeth Kamphuis博士（PEI，德国）解释说，提议的用于兽用疫苗批签发的SNT是一个定性的、最多是半定量的检测，结果为通过-失败。多重稀释的SNT可以与参考品建立平行关系，可用作补充的验证方法，并且可以用来计算IU。多重稀释的SNT将可能被指定用于评估待测和参考疫苗批的稳定性、对新的标准品进行校准，并用于评价制造工艺的改变。此外，Kamphuis还描述了一种特异性的替代人用狂犬病疫苗效力试验的多重稀释SNT的研究进展，监管当局和制造商提供了材料和分析设计方面的支持。目前的开发努力都集中在鉴定和优化该方法，包括确定所用小鼠的最佳年龄、免疫接种的数目，可能使用肌内而不是腹腔内接种。监管机构可能需要有定量的数据才会接受人用狂犬病疫苗批签发鉴别检定的结果。
3.2. 研讨会讨论
在研讨会的参与者中关于SNT的具体参数和相关的变异有相当多的讨论。具体来说，较老的老鼠拥有更成熟的免疫系统，在验证研究中接种疫苗后可能比年幼的动物产生稳定得多的血清学反应。Bruckner等人1988年报告了5-7周龄大的小鼠在接种疫苗后有一致的更高的抗体反应。此外，与标准的3-4周龄小鼠相比，9-11周龄接种疫苗的小鼠的中和血清滴度的差异减少了2倍。
检测血清学反应区分合格和不合格疫苗的最优时机，被认为是在单次、非加强的免疫接种后的第14天。然而，Wunderli指出，当前可用的数据表明，免疫接种的时间延长为21-28天，而不是当前建议的14天，可以提供更准确的效力测量和/或减少相关变异。研讨会的与会者讨论了SNT的变异性并建议应考虑制备国际标准品。
研讨会的与会者普遍认为，SNT检测有一个可以接受的、标准化的方案，该方案已经经过了充分的验证，可用于评估兽用狂犬病灭活疫苗的效力。但是，也提出了关于恰当检测低效力批的测试能力的一些考虑，建议产品特异的验证应包括补充的样品(批)，这些样品已被当前小鼠攻击试验确定为低效力。为此可能需要人为地生产一些低效力疫苗。
各个制造厂商必须在获得监管部门的批准之前进行替代检定方法的产品特异的验证。从历史上看，取代现有的检测需要进行比较研究以证明两种方法之间在统计上是等价的。由于与小鼠攻击试验相关联的固有变异性，定量相关性研究表明，证明这样的等价性可能是不可能的。虽然SNT检测低效力疫苗批的能力必须得到证明，监管当局也表示，他们认识到与定量相关的问题的复杂性，他们在进行产品特异的验证时，会邀请制造商进行开诚布公的对话。监管部门还鼓励制造商考虑通过详细的标准操作程序(SOP)和过程中检测控制来证明生产条件的一致性，以此补充他们的检定验证。已有推荐的SNT产品特异验证指南。
3.3. 建议
• 使用血清学方法（即疫苗接种和中和抗体的检测），而不是效力测试的攻击试验，将避免显著的疼痛和痛苦，避免关系到工作人员安全问题的动物活狂犬病毒的使用。相比攻击试验，该方法也可以显著减少动物的使用。
• 基于SNT实验室间的验证研究的结果和对欧洲药典灭活兽用狂犬病疫苗专题0451中所描述的方法的认可，认为SNT已经完全标准化，可提供一个代替小鼠攻击试验的框架，。因此，提出以下的建议：
Ø 鼓励兽用狂犬病疫苗生产商与相关监管机构合作和協商，启动使用SNT血清学方法的具体产品的验证。验证应包括确定SNT是否可以识别效力不达标批，以及SNT结果与目前的攻击实验结果相关的程度。
Ø 根据欧洲药典专题0451建立的规定和指南可以促进在全球范围内实施这种方法。
Ø 兽用和人用疫苗的多个稀释度SNT的验证，应继续用于待检和参考疫苗稳定性的定量评估，用于校准新标准，并用于评估制造工艺中的变化。
Ø 在可行的情况下，特别是对于非佐剂疫苗，鼓励制造商考虑在批签发效力实验中直接改用抗原定量测试。
Ø [ Biologicals (2012), http://dx.doi.org/10.1016/j.biologicals.2012.07.005 邱 松译 严家新校 ]
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