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狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会报告(2) 小鼠攻击试验
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人用和兽用狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会报告：
2. 测定狂犬病疫苗效力的小鼠攻击试验
Peter Wunderli博士（NED Biosystems，美国）介绍了目前采用的小鼠狂犬病攻击实验，并提供了多方面的批判性分析。当前的小鼠攻击试验：
• 每次实验使用至少120只小鼠，所有这些小鼠接受脑内活狂犬病毒注射，约50％的小鼠在安乐死之前经历无法缓解的疼痛和痛苦。
• 会产生非常不同的结果，在评估效力时可能有高达400％的差异。
• 产生大量的无效检定，一些实验室的报告达到42％。
• 对于用同样的巴斯德分离株生产的疫苗，使用非自然的传染途径（例如脑内）和疫苗接种途径（例如腹腔内），同时采用一致接受的攻击病毒株，可能导致相对效力结果的人为增加。
正如Alexander Gaydamaka博士（AHI，美国）所解释的，疫苗制造商在发展可供替代的方法上面临相当大的挑战，包括：资源的限制，大多数兽用狂犬病疫苗中佐剂的存在、可以干扰准确的抗原定量检测，以及需要法规的协调，以避免出口产品的重复检定。Holger Kost博士（诺华公司，德国）指出，对于任何提议的效力检定替代方法，认识和确保公共健康和/或产品的安全性是至关重要的。因此，许多与会者指出，在短期内，当前小鼠的攻击实验将继续在全球范围内使用。
2.1. 优化动物使用的替代方案
2.1.1. 科学现状
狂犬病疫苗的效力试验从两个方面引起动物的疼痛和痛苦。首先，在试验动物的大脑中进行活病毒悬浮液的脑内注射，其次，未受保护的动物会出现临床狂犬病。
活狂犬病毒的脑内（IC）注射是一种侵入性和痛苦的过程。一些监管指南和出版物提供了合适的IC注射技术指导。小鼠狂犬病效力攻击试验中所做的IC注射足以引起导致小鼠早期死亡的创伤性组织损伤。因此，监管条例规定，注射5天内发生的死亡认定为非特异性的，而不属于狂犬病毒感染。经验丰富的技术人员是必不可少的，以确保效力数据库的一致性和可靠性。WHO手册和美国农业部文件SAM308提供了注射技术的一些指导，一个最佳的灭活狂犬病疫苗效力检定的实践指导由Bruckner等人提出。 德国和日本一直使用着装备有套筒、提供均匀注射深度的特殊针头，是一个重大改进。
人道终结点是一次实验尽早结束的标准，以减少发生在实验过程中疼痛或痛苦持续时间和/或降低严重程度。美国和欧洲的监管机构都制定了具体政策，在对人用和兽用狂犬病疫苗进行现行的小鼠狂犬病疫苗效力攻击试验时，以非致命性的人道终结点作为实施动物安乐死的基础。瘫痪、麻痹、和/或抽搐作为狂犬病疫苗效力实验的人道终结点，因为它们已被证明能准确地预测临床狂犬病毒感染，并表明出现这些体征的动物最终将死亡。小鼠狂犬病疫苗效力攻击实验中人道终结点的早期识别和使用的详细信息和训练资料录入一个人道终结点-致死参数（HELP）组视频产品，命名为“狂犬疫苗批效力实验中人道终结点替代死亡参数”。该视频在实验室动物实验人道终结点网站上可获得，网址 http://www.humane-endpoints.info/eng/，也可在NICEATM-ICCVAM主页iccvam.niehs.nih.gov.上得到。尽可能使用可用的科学有效的人道终结点是美国公共健康服务政策中关于实验动物人文关怀和使用的一项基本原则，也载入美国和欧洲联盟现行的动物福利法规。
2003年ECVAM研讨会第48号报告"灭活狂犬病疫苗质量控制的3Rs方法" 提供了一个关于小鼠攻击实验中人道终结点和用于记录临床症状进展的评分表的综述。该报告还建议，体重减少15％或更多，加上第2阶段（丧失警觉性、转圈）或第3阶段（共济失调、全身颤抖、抽搐）的神经系统表现，可据以更精确地确定 “不可逆转时间点”，从而允许在出现瘫痪、麻痹、抽搐等症状之前早得多的时间点就终止一个实验。
虽然体重降低在当前任何狂犬病疫苗攻击试验的人道终结点指南中未被规范，体重下降结合早期神经系统体征（例如，缓慢的圆周运动，后肢缺乏协调）已被发现是一种早于瘫痪、麻痹、抽搐等症状出现的有用的较早的终结点。最终会出现临床狂犬病和死亡的小鼠，在注射后第4天开始体重会下降，而在注射后第6-9天则会出现显著的体重减轻（> 20％）。死亡的平均时间为注射后的10.8天。这些数据支持使用体重减轻结合早期神经症状，作为提早终止实验的人道终结点。
2.1.2. 研讨会讨论
研讨会与会者认识到，狂犬病疫苗效力检定的最终目标是完全不用动物做试验。然而，人们普遍认为，如果仍然必须使用动物，则应该以尽可能人道的方式来使用，应该仅仅使用最小数量的动物，同时确保所检定的疫苗批的效力。
与会者讨论了如何减少或避免传统IC注射程序的疼痛和痛苦。兽用疫苗生产商、一个人用疫苗制造商和一个国家控制实验室（即PEI）报告了按当前检定方案使用吸入或注射麻醉剂麻醉动物的常规IC程序，对测试结果无不利影响。与会者一致同意，以此丰富的经验为基础，应大力鼓励IC注射采用全身麻醉，并应纳入到现行的方案，以及人用和兽用狂犬病疫苗监管指南。监管机构的代表指出，在实施这种替代方法时，并不要求制造商额外进行产品特异的验证研究。欧洲和美国的动物福利法律和政策都要求考虑和使用按3R原则的替代方法，因此，对于动物的任何IC程序也应始终考虑使用全身麻醉。
研讨会与会者还讨论了IC注射后使用止痛剂，作为一种可能的方法，以尽量减少或避免注射后的疼痛和痛苦，也进一步减少经历早期狂犬病临床症状动物的疼痛和痛苦。缓释镇痛药丁丙诺啡可有效地抑制啮齿类动物的痛苦长达72小时。研讨会与会者建议研究并评估在IC程序中间、临床症状出现之前或开始时镇痛剂的使用，以确定它们的使用是否会影响有效的研究结果的产生。一些与会者质疑镇痛剂是否可能掩盖用于评估非致命性终结点的临床症状。但是，镇痛剂预计不会影响到作为人道终结点的神经系统体征（如：麻痹、瘫痪、抽搐），因为这些结果来自中枢神经系统的组织损坏，而不是疼痛诱导出来的。在IC程序后多天再进行一针或多针注射的一个担忧是与处理已受感染动物相关的安全风险。
在研讨会后，美国农业部发出一个兽用生物制品（CVB）中心公告：“大力鼓励在小鼠狂犬病疫苗攻击实验脑内接种时使用全身麻醉”。CVB公告12-12号还提供了生物制品检定的人道终结点补充指南，并重述了狂犬病攻击实验中有关人道终结点的指南。最后，在动物研究和效力实验中，如果可以证明并不影响研究结果，应鼓励使用镇痛药。
研讨会与会者还讨论了活狂犬病毒攻击小鼠的两个备用的接种途径：小鼠鼻内和外周狂犬病攻击（rabies peripheral challenge, RPC）实验。美国农业部CVB评论他们进行的一项研究，以验证为狂犬病毒感染使用的一个更安全、非侵入性的鼻腔（i.n.）攻击方法（采用全身麻醉）。如果发现是一个足够有效的替代方法（即不对检定结果产生负面影响），CVB会考虑发布实施指南。在研讨会的讨论中，监管机构的代表指出，可能不要求制造商进行额外的产品特异的验证研究。
RPC实验赋予了比NIH实验更显著的优势，其中包括：废除IC攻击；一个更自然的感染途径；通过测量疫苗的主要免疫原性增加敏感性，以及使用更成熟的小鼠和较高的病毒攻击剂量以减少差异。简单地说，RPC实验使用单剂量疫苗的肌内给药（i.m.），28天之后通过肌肉注射攻击狂犬病毒。 一个单一剂量的肌内疫苗接种更能代表常规的疫苗接种方式，并已被证明比单剂量腹腔注射人用或兽用狂犬病疫苗增加对小鼠的保护。 因此，除了以上所述，RPC实验赋予了狂犬病疫苗检定更多的优势。然而，RPC实验的实施可能会要求产品的具体验证。虽然研讨会参与者认为今后的工作重点应放在替换疫苗接种－攻击试验，他们建议WHO狂犬病专家委员会考虑RPC实验的验证和使用。
2.1.3. 建议
下面的指南建议在必要时进行小鼠狂犬病疫苗效力攻击实验：
• 对于还没有实施的地方，监管机构和全球标准制定组织应鼓励：
在所有人用和兽用狂犬病疫苗小鼠狂犬病攻击实验的国内和国际实验法规和指南中立即加入有关人道终结点的要求。
所有的监管指南中应规定在小鼠的攻击过程中常规使用麻醉剂和适当的技术用以减少与IC注射活狂犬病毒相关的疼痛和痛苦。
提供镇痛药以避免或尽量减少与IC注射狂犬病毒有关的程序后的疼痛与痛苦，然后研究确定研究结果没有受干扰。同样，应进行调查以确定提供镇痛药是否能在无保护效果的动物中避免或尽量减少与临床狂犬病发病有关的疼痛与痛苦，同时又不会干扰研究结果。
2.2. 减少动物使用的替代方案
2.2.1 .科学现状
目前各个国际监管机构用于检测灭活狂犬病疫苗效力的小鼠攻击实验方法，在几个方面都有变化，包括：疫苗稀释液的最低倍数，每一种稀释剂量组实验小鼠的最低数量，小鼠是否接受单剂或多剂量的疫苗，以及测试有效性的标准。例如，每种稀释剂量组使用的小鼠的数目当前要求的范围是从10只到18只。考虑到每次测试至少采用3个稀释度，与每组采用最低数目的小鼠相比，每组采用最高数目的小鼠可以导致多用80％的动物。
2.2.2. 研讨会讨论
研讨会与会者考虑了几种方法来减少当前小鼠效力试验的小鼠数目，包括：1）减少检定时每个稀释度所用小鼠的数量，2）减少稀释度的数目，3）限制重复检定，和4）同时检定多个批次。
由于当前小鼠攻击实验固有的误差，许多与会者表示不愿意在所有的稀释度中减少老鼠的数量。然而，某些疫苗制造商建议，在预计分别有100％或0％死亡率的赋形剂对照组、阳性对照组和疫苗稀释组，可以使用较少的小鼠。这个方案将马上提供一个机会，可以减少不同稀释度所需试验动物的数目。事实上，一家疫苗生产商已报告了在他们的实验方案中分别减少不同稀释度所使用的动物数量，而不会影响检定结果。然而，正如上文所述，小鼠攻击实验有高达42％的实验未能满足有效性标准，可能明确需要重新检定。减少稀释度的数量或每种稀释度动物的数量的努力可能导致更多无效的检定。由于无效实验和随后重复实验的增加，可能反而会增加动物的使用，因此需要评估3Rs的优点。然而，每年检定大量疫苗批的实验室，有足够的专业知识和检定经验，让他们积极追求减少小鼠和/或稀释度的数量。
在2003年灭活狂犬病疫苗3Rs方法质量控制ECVAM研讨会报告 48中，参加者建议国家监管当局调查是否可以在兽用和人用狂犬病疫苗的效力实验中引入一个单一稀释度版本的小鼠效力试验，因为它已经成功地被一个欧洲监管当局建立。然而，本次研讨会参与者并不鼓励针对实施单稀释度检定进行进一步的验证工作，因为它不能产生量化的数据，而且因为它只会产生一个通过/失败的结果，不能给出一个效力数值。此外，对没有效力数值的疫苗批的稳定性试验是很难解释的。
正如前面提到的，目前许多国家的人用狂犬病疫苗的指南要求重复测试以获得两个有效的小鼠效力试验的几何平均值。这一要求是由小鼠攻击实验的历史性质所驱使，可接受的P = 0.95的置信区间限定在25％和400％估计效力之间。Sunil Gairola 博士（印度血清研究所，印度）报告，以提交生产数据和检定的一致性为条件，监管部门依据单次检定就可发放许可，结果使用小鼠的数量减少了50％。根据从2007至2010年经相关的国家质量控制实验室进行复核（即：每批两次检定）的数据，这样单次检定的超过75批产品都证明了生产的一致性。在每个第6批产品的效力检定继续进行两次实验的条件下，监管当局对单次检定的产品都予以批准。
鼓励疫苗生产企业进行研究和/或提供历史数据来支持取消目前要求的重复检定。单次检定的认可，将减少高达50％的人用狂犬病疫苗批签发检定所需的小鼠数量。当一个单次检定被考虑认可时，也应该建立标准，如由美国农业部（USDA）提供的允许采用单次效力试验的标准。美国和欧洲的监管当局估计人用和兽用狂犬病疫苗验证检定所用的小鼠总数为每年6000至9200只。研讨会与会者建议，通过严格的生产控制，来免除监管当局进行验证实验的需要，以避免重复检定。
目前，监管当局允许在同一时间检定多批次疫苗。这就允许用单一的参考疫苗和攻击病毒的单次回复滴定（确认毒力）来进行多批次疫苗的检定，可显著减少小鼠的使用。 例如，相同的阳性对照和赋形剂对照组可以为几个批次的疫苗作对照，避免了为每批疫苗设立单独对照组的需要。多个疫苗制造商证实，目前他们在进行小鼠效力攻击实验时，都是在同一时间测试多个批次的疫苗，还同时进行样品稳定性试验。
2.2.3. 建议
不鼓励狂犬病疫苗替代性单一稀释法检测进行进一步的验证工作。然而，制造商应考虑减少试验所用的稀释度的数目，只要这样做并不增加无效检定和进行复检的数量。
鼓励制造商和监管机构研究如何降低每个疫苗稀释度(特别是较高和较低的疫苗稀释度)所需要使用的小鼠的数量，对于赋形剂和阳性对照组也有同样的要求。评估批签发效力数据的生物统计分析以确定是否可以减少稀释度的数目和/或每个稀释度所需测试小鼠的数量。
人用狂犬病疫苗制造商应回顾历史检定数据，以确定是否支持省去每一批疫苗所需要的小鼠效力平行重复实验。
为了进一步减少动物的使用，制造商应在可行的情况下，使用单一的参考测试疫苗和攻击病毒的一个单一的回复滴定，在同一时间测试多个批次。
监管当局应探讨建立标准以避免各个国家在疫苗进口时额外重复进行效力实验。
[ Biologicals (2012), http://dx.doi.org/10.1016/j.biologicals.2012.07.005 邱 松译 严家新校 ]
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