摘要

欧洲药典推荐两种兽用灭活狂犬病疫苗效价检测方法：第一种是经典的小鼠攻毒试验，该实验具有实验结果不精确、耗时，并且动物实验有悖伦理道德等缺陷。另外一种检测方法是用RFFIT检测免疫小鼠血清中的中和抗体来测定疫苗效价。尽管该方法具有快速、实验动物痛苦少等优点，然而该方法尚未广泛应用，而且有关这两种方法的比较资料很少。

我们因此进行了比较研究，该研究显示了用小鼠攻毒试验检测的结果与用RFFIT检测的平均中和抗体效价之间具有很好的相关性。小鼠攻毒试验显示没有免疫保护力的疫苗，在RFFIT血清学检测中的抗体效价也是很低的。本文进一步阐述了不同的给药途径对检测抗体效价的影响，并且提出关于血清学检测程序的一些修改方案，以便提高该检测方法的实用性。最后，我们推荐将血清学检测应用于灭活狂犬病疫苗效价的检测。

关键词：狂犬病疫苗；小鼠攻毒试验；NIH检测；血清学检测；RFFIT

1.      前言

依据WHO要求，应当用小鼠攻毒试验检测狂犬病疫苗效价。该实验方法最早起源于美国国立卫生研究院（NIH），因此该实验也被称为NIH检测。在该检测中，通过与疫苗标准品的比较，来检测一种疫苗对于狂犬病毒感染的保护力。在欧洲，NIH检测被强制应用于人用狂犬病疫苗效价的检测，一种改进的检测程序则推荐应用于兽用狂犬病疫苗的效价检测。

欧洲药典规定用以下的程序检测灭活的兽用狂犬病疫苗效价。包括标准参考品疫苗在内的待检测疫苗至少设置3个稀释度，每个稀释度分组至少检测10个动物。各个稀释度分组中每支小鼠腹腔免疫0.5ml。免疫后的第14天，所有小鼠脑内注射至少10 LD50剂量的狂犬病毒。记录死亡或者表现狂犬病症状的小鼠的数量，然后根据小鼠的存活率计算相对效价。只有当小鼠攻毒试验符合欧洲药典规定的一系列标准时，该实验才被认为具有检测的效力。只有当一种疫苗效价每剂至少达到1 IU时，该疫苗才符合要求。

NIH检测由于其不精确性以及显著的变异性被业界广泛批评。已经报道，NIH检测结果在实验室内和实验室间差异的曾有报导高达10倍。而且，该实验不能满足统计学方面的所有要求也是共性的问题。某一拥有长期检测经验的官方参考实验室报道，42%的NIH疫苗效价检测试验不能符合试验有效性标准。而且，NIH检测在伦理学和实践性方面也是受到质疑的。首先，该实验采用腹腔注射导致试验动物严重的损伤。其次，对照组和接种最低稀释度疫苗组的实验动物产生狂犬病症状，最终在攻毒试验中死亡。而且，NIH检测需要很多实验动物，费时（4周）而且价格不菲。此外，在攻毒实验中存在实验室工作人员暴露的风险。

1984年WHO专家咨询委员会意识到，目前的狂犬病疫苗效价检测方法不能精确提示新疫苗的免疫保护力，并且明确提出改进或者替代NIH检测的要求。其它的权威机构亦要求替代小鼠攻毒试验。一种适宜的备选方法应该满足以下的要求：1.　对实验动物造成更少的损伤而且所需动物数量更少。2. 更少的试验不确定性。3. 更快而且更容易操作。

根据欧洲药典要求，作为小鼠攻毒试验的替代，血清学检测可以被用于常规兽用狂犬病疫苗效价检测。该血清学检测每组至少免疫5只小鼠，免疫的剂量推荐为1/5检测疫苗剂量或者在小鼠攻毒预试验中摸索出的一系列令人满意的疫苗稀释度。免疫途径可以是皮下或者肌肉注射。注射后的第14天，采集血样，并且通过RFFIT来检测每个样品中的狂犬病毒中和抗体。只有当一种疫苗免疫产生的中和抗体效价不少于标准品疫苗产生的中和抗体效价时，该疫苗才符合效价要求。

血清学检测很显然地带给实验动物更少的损伤，需要更少的实验动物。但是，到目前为止，这种试验方法还没有被疫苗制造商和官方实验室广泛采用。几个研究机构已经证实NIH检测中小鼠的存活率与用RFFIT或者血清中和试验检测的小鼠狂犬病毒中和抗体效价有很好的相关性。RFFIT被进一步证明是一种具有很高重复性的试验方法。它通过测定狂犬病毒中和抗体保护培养细胞免遭狂犬病毒标准攻击毒株感染的能力，来检测血清狂犬病毒中和抗体效价。然而，目前还没有关于欧洲药典推荐的两种检测方法（NIH和RFFIT）之间的全面比较。

在本研究中，我们验证了小鼠攻毒实验结果与欧洲药典规定的血清学检测结果之间的相关性。而且，我们已经证实，血清学检测对常规疫苗质控的适宜性以及检测不符合质控要求的低效价疫苗的能力。此外，我们研究了这种替代方法的可行性，确定了应当优化的实验参数。本研究的总的目标是推进用血清学检测替代小鼠攻毒试验检测。

[ Biologicals, 2009, 37: 119-126, 唐　芳译，严家新校 ]

[译文载武汉生物制品研究所内部刊物《疫苗与免疫》2009,4(2)：40-42]