[ Expert Opin Biol Ther. 2012 Aug;12(8):1067-75.  霍玉奇 译 严家新 校 ]

 

   人们已经知道与针对狂犬病毒的保护作用相关的因子。狂犬病毒的糖蛋白（G-蛋白）是唯一可以诱导抗体产生并能与中和抗体结合的病毒抗原。它诱导的抗体水平大于0.5IU/ml就对动物和人起到保护作用。人们正在研究新的、免疫原性更强的狂犬病疫苗，只需接种一次就可以在实验动物身上产生保护水平的抗体。狂犬病疫苗可以分为减毒活疫苗、蛋白疫苗和基因疫苗。另外，佐剂可以增强现有疫苗的免疫原性。

 2.5.1  减毒活疫苗

   减毒活疫苗在野生食肉类动物中已使用多年。事实上，L.巴斯德给一个小男孩接种的第一支狂犬病疫苗，就是通过在兔子身上连续传代减毒，最后干燥的感染脑神经组织。狂犬病毒的致病性是由于它的中枢神经系统侵袭性，而减活的病毒不具备这种能力。狂犬病毒G蛋白介导病毒粘附在神经细胞上，如果G蛋白抗原表位III区的第333位的氨基酸精氨酸突变成谷氨酰胺，这种能力就会被减弱。G蛋白对于狂犬病毒在轴突中的迁移以及在跨越突触迁移中具有非常重要的作用，G蛋白第333位精氨酸变成谷氨酰胺后，病毒在神经细胞中迁移能力减弱。病毒的其它蛋白，如M和P蛋白主要参与病毒的播散、轴突运输、病毒复制或者影响宿主免疫应答，因此也是潜在的减毒位点。

   反向遗传学的出现使通过删除M或者P基因序列来构建高减毒株成为可能，同时也可以通过G蛋白基因突变来达到同样的目的。大部分研究中，减毒疫苗即使直接注射到无免疫功能的小鼠脑内也不会致病。新生小鼠脑内注射则观察到死亡现象。减毒活疫苗与灭活的野毒株疫苗相比免疫原性更强，单剂量注射后体内抗体就可以达到保护水平。一些重组病毒在暴露后接种仍然有效，细致的研究表明这与成功诱导固有和适应性免疫应答并同时增加了血脑屏障的通透性有关。由于上述作用，更多的抗体和淋巴细胞可以进入已受感染的中枢神经系统。经过缺失突变后的病毒是复制缺陷型，一般不会造成安全问题，而G基因突变型病毒仍然具有复制能力，可能构成安全问题。按成本/效益的观点，减毒活疫苗的缺点之一是生长慢，从而影响产量和最终成本。

 2.5.2   蛋白疫苗

   蛋白疫苗特别安全，与佐剂联合使用可以诱导持续的CD4⁺  T和B细胞应答。狂犬病毒G蛋白可以通过重组的办法表达于烟草叶或者玉米粒中。从烟草叶中提取的G蛋白肌内注射小鼠具有免疫原性，每次喂食小鼠5毫克含有50微克G蛋白的谷物同样有效。由于儿童可能不愿意吃生玉米，可以考虑构建其它表达外源蛋白的植物，它们更可口且不需要加热处理，如香蕉或者番茄。G蛋白口服疫苗需要口腔的淋巴细胞在疫苗进入胃之前将其摄取，不然疫苗进入胃中会被降解掉。由于小鼠口腔淋巴系统和人口腔的相比差异较大，因此在小鼠身上有效的植物口服疫苗在人身上是否有效还有待研究。

 2.5.3   基因疫苗

   基因疫苗含有G蛋白基因，转染或者感染细胞后表达G蛋白。由于蛋白可以进行有效的糖基化和折叠，因此可以诱导最广泛的抗构象依赖性的抗原表位抗体。所有的基因疫苗的缺点是在原位合成蛋白需要一定的时间，而实施PEP的时间是越快越好。所以基因疫苗只能局限于预防性疫苗接种。

   基于质粒载体的基因疫苗，也就是所谓的DNA疫苗。狂犬病DNA疫苗在小鼠、猫、狗和非人类哺乳动物中都可以诱导产生保护抗体。DNA疫苗安全、热稳定好，并且生产费用低。但在人身上，表达外源抗原的DNA疫苗免疫原性较弱。其它方法如电穿孔法可以增加注射部位细胞摄取质粒载体的量，进而增强身体对外来抗原的免疫应答。但对于群体儿童免疫，无论从实用、成本效益，还是接受程度上，电穿孔方法都需要做进一步的验证。

   病毒重组疫苗与质粒载体疫苗相比，免疫原性更强。通过改变来源于哥本哈根株的痘苗病毒 载体用来表达ERA株G蛋白的疫苗，称作VR-G疫苗，很多哺乳动物口服后可诱导保护性免疫应答。VR-G疫苗现在用于野生动物免疫接种。痘苗病毒重组疫苗具有很强的反应原性，因此不适合大规模的儿童疫苗接种。

   腺病毒载体也可以用来表达G蛋白。一般来说，腺病毒载体都删除了控制病毒内源性基因转录和病毒复制的E1基因。E1基因删除的腺病毒载体是复制缺陷型，因此除了大剂量注射情况下，常规剂量是安全的。腺病毒载体免疫原性很强，可以诱导针对G蛋白很强的免疫应答。腺病毒载体和腺病毒相似，在激活的T细胞内以低水平持续存在，一直处于转录活化状态；因此针对腺病毒载体的应答会维持在一个稳定的水平。人们不用担心体内含有低水平的腺病毒载体，因为大部分人都自然感染过腺病毒并且体内含有腺病毒基因组。未能整合到人基因组的腺病毒基因组会以外染色体的形式存在于细胞中，对感染细胞不构成任何危害。人在天然感染腺病毒后，体内有针对人血清型腺病毒的中和抗体。腺病毒特异性中和抗体会降低腺病毒载体的免疫原性。这可以通过使用所谓的人稀有血清型腺病毒载体或者来源于感染其它动物(如猴)的腺病毒载体来避免。表达G蛋白的腺病毒重组载体生长条件容易满足，已经有符合药品生产质量管理规范(GMP)要求的生产方法。

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