译者说明：本文原作者为世界上首例治愈狂犬病患者的美国医生Dr. Rodney E. Willoughby Jr.

摘要

在已经出现狂犬病症状时，注射狂犬病疫苗或者狂犬病免疫球蛋白（RIG）是无效的；而且要考虑到“早死”现象，即曾报导过的动物在注射狂犬病疫苗或者RIG后更快发生狂犬病。通过对动物实验原始数据中存活状况的分析，在两个物种中证实了以上结论。然而通过对文献报道的以及密尔沃基（Milwaukee）治疗方案登记系统中的人狂犬病案例分析，人类发生“早死”现象的风险较低。在人体内狂犬病疫苗或者RIG可能与蝙蝠狂犬病毒发生有害的相互作用。因而迫切需要开展蝙蝠狂犬病毒与蝙蝠来源的狂犬病疫苗和RIG之间相互作用的动物实验研究。

关键词

狂犬病；疫苗；免疫球蛋白

1.       前言

到目前为止，狂犬病一旦出现症状，一直认为是100%必死无疑。然而，到2004年为止的医学文献中共报道了5名通过病毒学实验室确诊的人狂犬病幸存者，这5名患者以前都曾接受过狂犬病疫苗预防注射，均未曾注射狂犬病免疫球蛋白（RIG），但后来都出现狂犬病症状。这5名幸存者中仅有2名没有并发明显的神经系统后遗症。2005年，我们报告了首例先前没有注射过狂犬病疫苗或者RIG的人狂犬病幸存者。经改进的长期观察表明，狂犬病毒野型病毒（街毒）株很少引起细胞病变，而且不能诱导细胞凋亡或者明显的炎症反应。人狂犬病患者存在可逆的、辅助因子介导的多巴胺和5-羟色胺代谢功能紊乱，因而我们推测狂犬病是一种神经传导功能紊乱性疾病。接受过现代危重症处治并存活了较长时间的病人在进行尸检时，其体内的病毒已被清除。这表明，机体固有的免疫应答能够清除体内感染的狂犬病毒。神经传导功能紊乱，包括自主神经功能异常，是狂犬病患者死亡的主要原因，因而通过麻醉抑制患者神经系统功能减退，直至机体产生固有免疫应答，似乎是一种合理的治疗措施。在哥伦比亚和巴西，这种成功的治疗措施被命名为密尔沃基程序“Milwaukee Protocol（MP)”，曾成功地用于2名狂犬病患者。据我们所知，对24名患者尝试了MP治疗，根据治疗意向分析，估计存活率能够达到9%。与接受传统治疗的对照组相比，经MP治疗的狂犬病患者的生存曲线明显延长。

MP治疗假定机体的固有免疫能产生针对狂犬病毒的免疫应答，并且禁忌使用狂犬病疫苗或RIG。这种治疗措施的理论基础有两方面。专家们的观点是在实验动物或者人类出现狂犬病症状后，狂犬病疫苗接种并无可验证的益处，而一名接受大剂量RIG治疗的患者曾发生脊髓灰质炎样疾病。另一方面，接种无效但有免疫原性的狂犬病疫苗可引起动物“早死”。“早死”现象的特征是与阳性对照组动物相比发病的潜伏期缩短。在动物被动转移实验中也能够观察到症状加重和早死现象。由于接种某些灭活狂犬病疫苗后感染狂犬病毒街毒株的实验动物出现更坏的结果，因而在出现狂犬病症状后完全应当禁止注射狂犬病疫苗或者RIG。

问题是多数狂犬病患者死亡时狂犬病毒血清学检测呈阴性，血清抗体阳转所需的时间可能很长。这就使得接受MP治疗的狂犬病患者必须承担相当大的风险，患者须一直处于全身麻醉状态直至脑脊液中出现中和抗体。我们应当尽量设法加快免疫应答的进程。据我们观察，许多患者在确定诊断或确认需要进行相关治疗前，即在首次出现疑似狂犬病临床症状时即注射了狂犬病疫苗或者RIG来预防狂犬病。然而这种预防治疗措施能够从根本上延长他们的生存时间、提高他们的生存质量吗？可能引起争议的是，前文所述的5名疫苗接种失效后的狂犬病幸存者，可能作为“疫苗成功”的例证，然而其中3名患者的生存质量和生存持续时间都是令人失望的。上述不良结果的解剖学基础不明，但3名患者出现痉挛症状时的临床细节是值得注意的。目前1名在疫苗接种失败后接受MP治疗的狂犬病幸存者在康复过程中出现痉挛症状。通过核磁共振成像（MRI）检测，患者大脑白质出现病理改变。为了阐明狂犬病发病期间接种狂犬病疫苗及RIG潜在的副作用，我们对历来的动物以及人类病例资料，包括接受MP替代治疗方案的病例资料，进行了回顾性分析。

2.       材料和方法

对1990年1月至2009年8月（20年）期间Pubmed收录的关于人狂犬病病例报告的英文医学文献进行了综合分析。对参考文献所涉及的病例报告也进行了收集。对文献所描述的狂犬病毒的来源、患者年龄、性别、从接受狂犬病疫苗或者RIG注射至出现狂犬病症状的时间等参数进行归纳。国际狂犬病治疗登记系统(International Rabies Treatment Registry)收集采用MP治疗的患者登记；作者了解到的少数未登记病例或在文献中报道的案例也包括在内。接受MP治疗的狂犬病患者不属于分析的范畴，其存活指数在回顾性分析中被剔除。我们亦追溯并且归纳了狂犬病实验动物出现“早死”现象的文献。我们应用Stata（第8版）软件对摘要的数据资料进行生存分析。凡病例报告未提及注射狂犬病疫苗或者RIG的患者都假定没有使用这些生物制品。这相当于预先假定如不使用生物制品则对结果无影响。

3.       结果

40年前，研究者们构建了一个暴露后预防（PEP）的实验动物模型。在该模型中，以狂犬病毒街毒株（山猫来源）攻击成熟雌性Swiss ICR小鼠，从而评估鸭胚狂犬病疫苗（DEV，Lilly）和BHK细胞狂犬病疫苗(Pitman-Moore vaccine公司生产)。狂犬病的潜伏期几乎持续到一年，狂犬病疫苗的治疗效果随时间而改变，由于“早死”现象引起生存曲线出现交叉。为了对“早死”现象进行统计学分析，我们的资料按31天进行筛选，以此作为山猫病毒攻毒后未进行主动干预的中位生存时间。注射BHK细胞狂犬病疫苗小鼠的生存率较注射DEV狂犬病疫苗小鼠的生存率高。不过，小鼠注射任何一种狂犬病疫苗后发病的时间较注射安慰剂的小鼠早。上述实验中出现明显的“早死”现象，即使疫苗仅能提供很弱的保护力。

同一批研究者们还研究了马源狂犬病免疫球蛋白（eRIG） 以及eRIG单独或 与DEV疫苗联合应用的效果。注射标准剂量eRIG的小鼠，没有出现明显的“早死”现象，相关效应在 14天后消失。

与此同时，研究者们以狂犬病毒街毒株（犬源）攻击恒河猴，进行了类似的评估，采用的疫苗有 DEV和BHK细胞培养的PM疫苗（PM/BHK）；人二倍体细胞疫苗（PM/HDCV）和猴肾细胞疫苗；以及其它类型疫苗。在暴露前预防（PreEP）实验中，研究者对小鼠的追踪时间为接种后的3个月，而在暴露后预防（PEP）实验中，结果在6个月后报告。为进行统计分析，按未经处理的感染对照的中位生存期为19天对资料进行筛选。DEV的治疗效果不佳，而PM/HDCV对PreEP有效，PM/BHK对PEP有效。猴子注射狂犬病疫苗后发病的时间较注射安慰剂的对照组早。当使用总体效力较差的疫苗时，再次出现了“早死”现象。

单独注射eRIG或者猴源性RIG以及联合注射PM/BHK疫苗进行暴露后预防（PEP）的研究结果表明，两种RIG早期治疗效果是相似的，因此实验结果可合并。然而单独注射RIGs或者联合注射PM/BHK疫苗，如果与安慰剂治疗的猴子相比则结果明显不同。注射14天后，RIG的“早死”效应消失。注射PM/BHK疫苗加或不加RIGs对早死的作用是相似的――没有证据表明有协同或者对抗作用。

另一些研究者开展了动物移植实验，以高度减毒的HEP狂犬病毒固定毒株攻击接受致死剂量照射的BALB/c小鼠，然后为这些小鼠移植骨髓、B或T淋巴细胞，或者输注未经免疫的以及经过狂犬病毒免疫（脑内途径攻毒4天后）的小鼠血清。确定移植了未免疫供体脾细胞的小鼠感染后的平均生存时间（例如接种后14天）；为进行统计分析，资料筛选的标准是比上述平均生存时间多一天。攻毒后，曾移植正常脾细胞的小鼠死亡，而那些曾移植免疫7天脾细胞的小鼠全部存活。曾移植加强免疫3天脾细胞的小鼠在攻毒后有72%得到保护，但所有死亡的小鼠全部出现“早死”现象。攻毒后，曾移植纯化的B细胞或输注免疫血清的小鼠，分别有22%和25%出现“早死”现象，而其余的或曾接受纯化T细胞或者正常血清的小鼠生存时间都较长。

我们随后追溯了1990年至今的全部狂犬病病例报道。我们剔除了其中合并AIDS或者接受器官移植的案例（这些狂犬病患者有生存时间延长的倾向）。剩余的64个案例大部分来自美国疾病预防控制中心（亚特兰大，乔治亚州）。我们依据未接受MP治疗患者的年龄（0-5、6-15、16-35、36-55、>56岁）、性别、死后诊断以及案例报道时间（按十年分组）等参数绘制生存曲线。感染犬狂犬病毒患者的生存时间较感染蝙蝠狂犬病毒患者的生存时间稍长。出现狂犬病症状后，注射狂犬病疫苗是无效的，然而注射RIG有延长生存时间的微弱趋势。

由于感染犬或蝙蝠狂犬病毒患者的生存时间可能有差异，我们研究了已知动物来源的狂犬病毒疫苗或者RIG之间的相互作用。出现狂犬病症状后，感染蝙蝠狂犬病毒的患者在注射狂犬病疫苗后较接受常规处置的患者更易出现“早死”现象。类似地，感染蝙蝠狂犬病毒的患者在接受RIG治疗时也有出现“早死”的倾向。此类患者中有许多都接受了疫苗和RIG。我们无法从统计上区分它们的效果。

根据MP治疗原则，狂犬病患者的治疗应禁用狂犬病疫苗和RIG，国际狂犬病治疗登记系统是在有治疗意向的基础上发挥作用，而多数MP治疗的患者接受了这样的免疫调整。对于接受MP治疗的患者，在症状出现后注射狂犬病疫苗或者RIG对结果无影响。由于样本数量太少，尚不能作出可靠的解释，但MP治疗中采用狂犬病疫苗或者RIG的结果与依据从文献收集到的病例进行分析所得到的结论是一致的：狂犬病疫苗倾向于对蝙蝠来源的狂犬病产生有害的作用，而对犬来源的狂犬病可能有益。 

4.       讨论

早期的研究人员在两个动物物种中采用同一种疫苗株进行研究，提出“早死”概念：使用狂犬病疫苗和RIG可能产生有害作用。我们采用生存分析对上述实验数据重新进行分析。我们认为“早死”现象似乎与狂犬病疫苗是否具有免疫原性（基于狂犬病血清学）或者效力（保护力）没有关系，并且提示保护力及其副反应可能存在不同的产生机制。早期研究在接受暴露前（PreEP）或者暴露后（PEP）预防的实验动物中都发现该现象。在这些实验动物模型中，RIG的有害作用不太明显，而且持续时间较短，或许与这些被动注射抗体的分解代谢相一致。早期实验研究结果显示，在狂犬病发病过程中确实出现了潜伏期的缩短或者疾病进程的加速，而移植实验的结果则肯定了免疫机制的存在，且其作用仅局限于出现临床症状及此前很短时期。从临床应用的角度考虑，曾进行过暴露前预防（PreEP）处置或在暴露后预防（PEP）期间发病的狂犬病人，以及已出现疑似狂犬病临床症状后才接种治疗性疫苗的病人，都有发生“早死”的风险。

采用现代细胞培养狂犬病疫苗并结合采用了野型攻击病毒进行动物实验，在两个动物物种中都得到相似的结果，这些动物实验研究是有说服力的。不过不同物种之间的免疫学肯定是有差别的；有些免疫细胞移植研究涉及针对减毒的实验室传代狂犬病毒的免疫细胞，在将这样的实验结果推广到野型狂犬病毒的致病性研究时必须高度慬慎。

来源于文献以及国际狂犬病治疗登记系统的人狂犬病数据资料，是直观可靠的。接受狂犬病疫苗或者RIG进行治疗与那些不采取这些治疗措施的人相比，生存率并无区别。这种研究途径的主要弱点是回顾性的病例系列研究依赖于治疗方法的披露，包括疫苗接种和被动免疫治疗，而这方面的记录通常是模糊或者不完整的。对所采用的狂犬病生物制品的错误归类会使结果失去意义。MP治疗登记系统强调提供这些信息，因而更加可靠。在这个尽管样本数量有限（n=24）的集合中，仍然没有任何证据可证明接种狂犬病疫苗或者注射RIG对狂犬病患者有治疗作用。

文献中普遍认为，犬狂犬病毒的毒力较蝙蝠狂犬病毒的毒力强，然而使人感到意外的是实际上犬源狂犬病患者的生存期较长。犬狂犬病较长的生存期可能仅在欧洲和北美洲有明确的证据，因文献中大多数病例都来源于这些地区；而且与狂犬病呈地区性流行的地区相比，这些地区具有更完备的医疗设施和丰厚的资源来延长生存期。在文献病例系列研究中，狂犬病的死后诊断对整个生存曲线没有影响，因此其对治疗的指导作用极小。

由于狂犬病患者的生存期与病毒的来源动物密切相关，我们按照攻击毒株是蝙蝠狂犬病毒还是犬狂犬病毒进行分组，分析疫苗和RIG对患者存活时间的影响。通过Kaplan-Meier生存函数分析，我们发现犬或者蝙蝠狂犬病毒和狂犬病生物制品（疫苗或者RIG）之间存在明显的相互作用。根据对已发表病例的分析，我们推测注射狂犬病疫苗或者RIG的感染蝙蝠狂犬病毒的患者可能出现“早死”现象。在MP治疗登记系统中，蝙蝠源狂犬病患者也出现同样的不良后果。然而对于感染犬狂犬病毒而接受MP治疗的患者，尽管样本数量很少，使用疫苗或者RIG似乎有一定好处。在文献报道的案例中，RIG的使用对犬源狂犬病患者也显示略有益处。 

上述人狂犬病案例的数据资料从生物学上来讲是合理的，但仍然需要更进一步认真研究。由于样本量很小，所发现的相关性可能仅是偶然发生。与动物实验不同，病毒暴露的严重程度、宿主的遗传学和适应性以及医护条件都存在很大差异。在承认这些差异的前提下，我们推测，同源性和异源性疫苗保护力的细微差异可能决定狂犬病疫苗(及其诱导的RIG)同蝙蝠和犬狂犬病毒之间明显的相互作用。在动物实验研究中，PM疫苗株为犬源(曾经牛和兔传代)，犬源病毒变种诱导的抗体或者细胞免疫可能对蝙蝠狂犬病毒产生不同的免疫应答。不过，“早死”现象很早就在动物中被发现，并局限于动物中而未在人类发现，因而可能还有其他不是那么微妙的机制在起作用。

移植实验提示，B淋巴细胞和抗体是产生“早死”现象的主要致病因素。在此类实验中，“早死”的临床症状与一般的鼠狂犬病明显不同，后者通常出现抽搐或者强直性痉挛而非瘫痪。“早死”小鼠的神经解剖结果是正常的，与街毒株感染极少引起形态改变的结果相似，而与高度减毒的HEP攻击毒株在敏感小鼠引起海马回炎症和坏死的情况截然相反。不过我们必须非常谨慎地看待这个模型，因为使用了放射线处理的动物以及高度减毒的攻击病毒。最早的“早死”实验表明，疫苗若不能诱导足够强的免疫反应从而给动物提供针对狂犬病的保护，则会在疯动物中引发“早死”现象。这提示固有免疫或者细胞效应因子可能在起作用。

大多数狂犬病毒疫苗株与街毒株的来源明显不同，因此狂犬病疫苗可能导致“早死”现象的推测是合理的。街毒株不引起细胞病变，仅引起轻微的炎症反应，但固定毒株却能够诱导细胞凋亡及重度炎症反应。这样的疫苗株诱导的免疫反应可能不同于自然免疫，这就正如有证据表明在人体中抗G蛋白和N蛋白表位的抗体存在差异。狂犬病疫苗诱导的免疫可能不会象辛德毕斯病毒（Sindbis virus）那样，以非溶解细胞的方式从脑中清除狂犬病毒，而是调用效应细胞和神经胶质细胞来发挥作用。神经胶质细胞的活化可能是在疫苗免疫失败后的狂犬病幸存者中引起抽搐以及脱髓鞘作用（MRI检测可发现）的原因。

我们的结论是，还需要作更多的研究以便弄清这个重要问题；迫切需要提高狂犬病患者的存活率；需要提高进行治疗尝试的兴趣。正如MP程序所明示的，人狂犬病的禁忌症仍然是相对的。来自文献以及MP治疗登记系统的初步资料表明，感染蝙蝠狂犬病毒的患者应该谨慎使用狂犬病疫苗或者RIG。在动物实验数据较丰富的犬源狂犬病研究中，这些生物制品对人狂犬病的效果的临床证据很欠缺，似乎略有好处。然而这后一结论引出另一个有趣的问题：其它的狂犬病疫苗，特别是减毒活疫苗以及与街毒株同源关系较近的疫苗，是否最终能够治疗犬源狂犬病。美国研究者们已经开始关于蝙蝠来源的狂犬病疫苗及其诱导的RIG的实验研究。犬狂犬病可能在全球范围内逐步得到控制，经蝙蝠传播的狂犬病将逐渐引起更多的关注。

[Vaccine 2009，27（51）：7173－7177　唐　芳译　严家新校 ]