如何快速而准确地鉴定蝙蝠中的狂犬病毒？(2)

前言：

目前中国的狂犬病监测主要是在家养动物（狗和猫）中进行，而对野生动物的狂犬病监测则还是一个薄弱环节，与美国和其他发达国家相比，每年检测的数量差距很大。绝大多数新型狂犬病毒都是在蝙蝠中发现的，其中可能有现有狂犬病疫苗预防效果很差甚至完全无效的新型狂犬病毒。因此让国内更多的狂犬病监测机构掌握在蝙蝠中快速而准确地鉴定狂犬病毒的方法很有必要。

以下介绍世界顶级狂犬病专家Charles E. Rupprecht博士主持撰写的一篇最新相关论文供参考。此论文去年发表在专业杂志《Zoonotic Disease (人兽共患病）》上，论文的题目是《Use of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Diagnosis of Rabies Virus in Bats（用直接、快速免疫组织化学试验鉴定蝙蝠中的狂犬病毒）》（见参考文献）。

2. 材料和方法

2.1. 样本

大脑样本来自疑似蝙蝠，这些蝙蝠分别在德克萨斯州和亚利桑那州作为常规公共卫生实验室检测或ERS（增强狂犬病监测计划）的一部分收集，如文献24（关于美国2019年的狂犬病监测）所述。在检测之前，将大脑冷冻(- 20至- 80°C)。第一次初步评估是对从德克萨斯州获得的编号的蝙蝠脑样本进行回顾性检查，这些样本已于2016年由德克萨斯州卫生部通过DFAT（直接荧光抗体检测）进行评估。在对先前的测试结果进行解盲之前，获得并记录了dRIT（直接快速免疫组织化学试验）的发现。

来自亚利桑那州的样本集合包括2016-2020年期间从蝙蝠中收集的大脑，作为ERS（增强狂犬病监测计划）的一部分，没有人类或家畜接触史，并由直接快速免疫组织化学试验(dRIT)进行了前瞻性测试。经过评估，结果得到纽约州卫生部Wadsworth中心狂犬病实验室采用DFAT（直接荧光抗体检测进行的确认。

2.2. 实验方案

　dRIT方案使用Wistar研究所生物素标记和纯化的抗RABV（狂犬病毒）核糖核蛋白小鼠单克隆抗体(MAbs) 502和802进行，如文献[25,26]所述。简单地说，在玻璃显微镜载玻片上留下蝙蝠大脑的触压印迹（touch impressions）。将载玻片风干，在10%的福尔马林缓冲液中固定10分钟，在含1% Tween 80的PBS洗涤缓冲液 (TPBS)中浸泡10分钟，在3%过氧化氢中浸泡10分钟，然后在新鲜配制的TPBS中浸泡。浸渍后，将载玻片上多余的缓冲液摇动去除，并从边缘开始吸干(每次冲洗后重复)。载玻片与抗RABV（狂犬病毒）单克隆抗体一起在湿盒(即在湿纸巾上加塑料盖)中孵育10分钟，在TPBS中浸洗，与链霉亲和素-过氧化物酶复合物（streptavidin-peroxidase complex）孵育10分钟，并在TPBS中浸洗。3-氨基-9-乙基咔唑（ 3-amino-9-ethylcarbazole，AEC) 原液的制备是将1片20 mg AEC片溶于4 mL N, N-二甲基甲酰胺（ N, N-dimethylformamide）中。工作稀释液的制备是将1ml AEC原液加入14ml 0.1 mol/L醋酸缓冲液和0.15 mL 3%过氧化氢中。载玻片与AEC过氧化物酶底物孵育10分钟，在蒸馏水中浸洗，然后用Gill #2苏木精配方反染，用蒸馏水1:2稀释2分钟，在蒸馏水中浸洗。载玻片用水溶性包被介质安装，用光学显微镜(Leica Microsystems Inc.，Buffalo Grove, IL, 60089, USA)在200倍到400倍的倍率下检测典型RABV抗原(即，使用本方案选择的显色原，在微弱的蓝色背景下显示为品红染色的内含物)，与阳性和阴性对照脑样本进行比较。dRIT数据生成后，选择DFAT对蝙蝠大脑的结果作为可提供可靠信息的金标准，定义真阳性、真阴性、假阳性和假阴性值。

2.3. 结果分析

根据直接快速免疫组织化学试验(dRIT)结果与DFAT（直接荧光抗体检测）结果的比较，计算诊断敏感性(Se)、特异性(Sp)、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。

（未完待续）　　

参考文献：

Charles E. Rupprecht，et al., Use of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Diagnosis of Rabies Virus in Bats，Zoonotic Dis. 2022, 2(1), 1-8;　https://doi.org/10.3390/zoonoticdis2010001.

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