第三代狂犬病减毒活疫苗在家犬中的应用效果(4)

前言：

人类的狂犬病99％是由狗传播而来。为了实现全球在2030年消除经狗传播的人类狂犬病的宏伟目标，必经之路就是通过给狗普遍接种疫苗消除狗群中的狂犬病。狗群中的狂犬病消除了，人的狂犬病也自然就消除了。但要给狗特别是流浪狗通过打针接种疫苗是一项艰难而危险的工作。如果能开发出安全有效的口服（食饵）疫苗，则将带来极大的便利。口服（食饵）疫苗通常都是减毒活疫苗，欧美国家将口服减毒活疫苗用于控制多种野生动物的狂犬病，曾取得巨大的成功。但若要将口服减毒活疫苗用于家养动物狗，则在安全性方面要求更高，因为口服活疫苗用于狗以后，与人和其他各种家养动物直接接触机会更多，必须确保对人和家养动物有更高的安全系数。而且许多在野生动物中有效的口服疫苗对狗的效果大打折扣，因此迫切需要开发符合更高标准的口服疫苗用于作为家养动物的狗。世界各国包括中国在内的狂犬病研究人员多年来一直在进行适用于狗的口服狂犬病疫苗的研发工作，德国的研究人员多年在这方面处于领先地位。

在今年１月30日出版的世界最著名的疫苗学专业杂志《Vaccines》上，德国的相关研究人员发表了一篇研究论文（见参考文献），介绍第三代口服狂犬病疫苗应用于家犬的最新研究进展。

适用于狗的安全有效的新一代口服狂犬病疫苗也是中国非常迫切需要的，这篇文章的内容，包括一些实验细节，都是值得我们认真学习、参考的，所以以下分数次较详细地译介这篇研究论文的主要内容。

2.　材料和方法（2） 

2.6. 采样方案

共采样11次，样品编号为B0－B10。采样时间B0是在疫苗接种前14天，其余都是在疫苗接种后不同天数（days postvaccination，dpv)，分别是在10 (B1)、16/17 (B2)、31 (B3)、45 (B4)、59 (B5)、94 (B6)、129 (B7)、157 (B8)、185 dpv(B9)和研究结束后(B10)采集血液样本。在第二研究阶段，由于废水灭活剂存在技术问题，病毒攻击感染被推迟了14天。因此，在199 dpv从相关动物中收集了额外的血液样本。

采集后直接检测B0、B3血样(ELISA)。因此，已知所有动物在接种疫苗前狂犬病抗体检测呈阴性，大约在接种疫苗后1个月，28只狗的血清检测呈阳性，12只狗的血清检测呈阴性。基于这些结果，研究人员决定，所有5只备用的动物不必被纳入研究的最后一部分，如果其他35只动物在攻击前的研究阶段都幸存下来，则这５只狗可以安置回家。备用动物根据芯片识别号的后3位数进行筛选;3只接种疫苗的狗和2只对照狗都是依据3位数最高的标准而被确定为备用动物。

血液样本(每个样本约5-6 mL)取自四肢的大的浅静脉(例如 V. cephalica antebrachii, V. saphena)，通常不使用镇静剂，使用采血管(S-Monovette, Sarstedt, Nümbrecht，德国)。在研究结束时(在执行安乐死前)，最后的血液样本是在深度全身麻醉下通过心内穿刺获得的。血液样本在3500g下离心15分钟，然后将血清存储在- 20◦C和- 35◦C之间，直到实验室分析抗体的存在。

2.7. 病毒攻击试验方案

第1和第2阶段的动物分别在疫苗接种后第天185天和第199天（dpv）接受病毒攻击。在第一阶段，对13只接种过疫苗的狗和5只对照狗进行了病毒攻击，在第二阶段，对12只接种疫苗的狗和5只对照狗进行了病毒攻击。稀释后的攻击病毒滴度为10 ^3.6 MICLD 50 /mL。肌注1.0ml，左、右咬肌各0.5 ml。

攻击病毒接种后，每天至少对犬进行两次狂犬病临床症状监测，并记录临床评分，如前所述。一旦临床评分达到2分或更高，动物就会被安乐死。

从每只出现临床症状后被安乐死的动物和感染后91天结束时所有余下来的动物的大脑采集样本用于狂犬病诊断。

2.8. 诊断方法

2.8.1. 阻断式酶联免疫吸附试验(bELISA)

用于检测狂犬病毒特异性结合抗体，如所述，使用市上可用的bELISA (BioPro Rabies ELISA, 捷克共和国)。简而言之，血清样本在包被有狂犬病毒抗原的微量滴定板上孵育。除去血清后，所有孔都与一定量的生物素标记的狂犬病特异性抗体孵育。结合后的抗体用过氧化物酶偶联链霉亲和素（streptavidin）孵育，然后进行显色检测。根据制造商的说明，该测试用于检测狂犬病特异性抗体，阻断百分比(percentage of blocking ，PB)低于40%为阴性，PB等于或高于40%为阳性。

2.8.2. 快速荧光灶抑制试验(RFFIT)

在改良的快速荧光灶抑制试验(RFFIT)中检测血清中病毒中和抗体(VNA)的存在，如前所述，使用狂犬病毒CVS-11毒株作为测试病毒,采用BHK21-BSR/5细胞。参照WHO国际标准免疫球蛋白(第二批人类狂犬病免疫球蛋白制剂，英国国家标准与控制研究所)调整为0.5国际单位(IU)，阳性和阴性血清分别作为阳性和阴性对照。

VNA滴度在R studio中采用非线性回归拟合S型函数（ sigmoidal function）计算，随后将其转换为IU/mL表示的浓度。RFFIT血清阳性的临界值为0.5 IU/mL。

2.8.3. 狂犬病的实验室诊断

采用荧光抗体试验(FAT)检测脑样本中的狂犬病毒抗原，可确诊狂犬病。实验过程包括用一块大脑样本涂抹载玻片，风干并固定。用市售FITC抗狂犬病超免疫血清对该组织涂片进行染色，并在荧光显微镜下进行检查。对于可疑的结果，对其大脑样本还使用RT-qPCR检测狂犬病毒特异性RNA的存在，用狂犬病组织培养感染试验(RTCIT)以分离病毒。

2.8.4. 　遵守伦理标准 

 遵守所有适用的国际、国家和/或机构的动物护理和使用准则。动物居住安置是根据适用的准则进行的。该研究得到了德国萨克森-安哈尔特（Saxony-Anhalt）州主管当局的批准。

2.9. 　统计分析

对于几何平均滴度和95%置信区间的计算和图示，使用软件GraphPad Prism 9.0 (GraphPad软件公司，美国加州圣地亚哥)。

（未完待续）

参考文献：

Bobe, K.; Ortmann, S.; Kaiser, C.; et al. Efficacy of Oral Rabies Vaccine Baits Containing SPBN GASGAS in Domestic Dogs According to International Standards. Vaccines 2023, 11, 307. https://doi.org/10.3390/vaccines11020307 

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