编译：jacky，编辑：小菌菌、江舜尧。

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为了确定抗真菌候选药物，作者开发了基于LC-MS的代谢组学、基因组学平台，利用从海洋动物微生物组中分离的细菌，对其进行代谢组阵列的抗菌活性筛选。本文中，作者描述了一种很有前途的抗真菌药——turbinmicin的发现和早期开发，它是从海鞘微生物组中的Micromonosporasp.中分离出来的。该化合物在体外和体内对包括耳念珠菌在内的新出现的多重耐药真菌病原体表现出广谱活性。Turinmicn的安全性和对耳念珠菌和烟曲霉的高度选择性作用机制(MOA)支持该化合物的临床应用开发，同时也揭示了一个可利用的真菌靶点。

化合物的多样性对新药物的发现至关重要。为了建立多样的化合物库，作者对2012年至2016年在佛罗里达群岛收集的1482株海洋无脊椎动物放线菌进行了LC-MS图谱分析。然后，作者使用他们最近开发并发表的基于LC-MS的代谢组学工具-HCAPCA(层次聚类分析主成分分析)，对菌株进行优先度排序。HCAPCA的数据使作者优先考虑174种化学成分不同的菌株。如PCA评分图(图1C)所示，WMMC-415菌株从组中分离出来，表明其存在化学差异。PCA负荷图(图1D)显示了一些导致差异的化合物，包括turbinmicin。发酵后，用两步正交色谱法将化合物分子排列到174个96孔板中。通过高通量筛选，作者评估了这些代谢组化合物对白色念珠菌的体外活性。根据效价、MS和核磁共振，作者发现了来自小单孢菌的抗真菌药物-turbinmicin(图1)。turbinmicin属于一小类高氧化II型聚酮化合物。虽然代表性的II型聚酮药物如actinomadurone，lysolipin，和xantholipin显示出一系列的生物活性，但它们没有一种经过活性机制的全面评估，结构的变化可能会影响其活性谱。

图1 使用MDR药物发现平台从海洋微生物中发现Turbinmicin。(A)从海鞘中分离到一株产Turbinmicin的菌株。(B) Turbinmicin产生菌-Micromonospora sp.WMMC-415。(C和D)WMMC-415在进行HCAPCA处理后，根据其化学多样性被优先排序。PCA计分图(C)显示了WMMC-415的化学多样性，PCA负荷图(D)显示了WMMC-415产生的许多不同的代谢物，包括Turbinmicin。(E) Turbinmicin的结构。(F) Turbinmicin的X射线ORTEP图。

作者使用高纯度的turbinmicin进行扩大的、临床相关的体外抗真菌筛选实验，并通过测定小鼠模型的最大耐受剂量(MTD)进行体内有效性和安全性评估。为了评估turbinmicin的活性谱，作者使用来自临床实验室标准研究所(CLSI M27和M38)的微液法分析了它对39株临床分离菌的活性。这些临床分离株包括MDR病原菌，代表了已知耐药机制的常见真菌病原菌 (C. albicans，C. auris，Candida glabrata，Candida tropicalis，A. fumigatus，Fusarium spp.，Scedosporium spp.，和Rhizopus spp. )(图2A和表S2)。例如，这些菌种包括多重耐药的C. auris[菌株B11211, turbinmicin最小抑菌浓度(MIC)为0.25 mg/mL，fluconazole的MIC大于256mg/mL，amphotericin B的MIC为2mg/mL,micafungin的MIC为4mg/mL]，耐echinocandin和triazole的C. glabrata，以及triazole耐药的A. fumigatus。除zygomycetes需要4-8mg/mL的浓度才能抑制其生长外，大多数菌属的turbinmicin最小抑菌浓度为0.03-0.5mg/mL。Turbinmicin对现有的抗真菌类耐药菌表现出类似的活性，表明其缺乏交叉耐药，并可能具有独特的活性机制。作者选择了C. auris的多重耐药分离株，以进一步研究不同浓度的turbinmicin随时间变化的药效学特性。在超过MIC的浓度下观察到了杀菌活性，在最高浓度时，在4小时内可以使微生物数量下降超过2-logCFU (图2B)。

作者通过人红细胞(RBC)溶血试验和小鼠模型MTD初步测定了Turbinmicin的安全性。Turbinmicin在超过最低抑菌浓度1000倍剂量下没有表现示RBC毒性，表明该化合物具有广阔的治疗潜力(图2C)。为了确定MTD，向小鼠注射turbinmicin，剂量从1mg/kg逐次增加两倍。最终，小鼠在高达256mg/kg的剂量水平时没有表现出毒性反应。随后，作者使用美国食品和药物管理局(FDA)标准真菌模型研究了侵袭性念珠菌病的体内疗效。将念珠菌注射到模型小鼠的血液中，并通过肾脏中的活真菌数评估治疗效果。注射了耳念珠菌(菌株B11211)的小鼠在24小时内每隔6小时注射一次turbinmicin(剂量从0.25增加到4mg/kg，每次增加两倍)。作者观察到了浓度范围内的剂量依赖效应，与对照组小鼠相比，在最高剂量水平下的真菌数量降低了3.6log10CFU(图2D)。没有任何小鼠在剂量范围内观察到毒性的迹象。值得注意的是，Turbinmicin在这些模型中显示的抗真菌活性与这些感染模型中的疗效有很好的相关性；事实上，真菌数量的减少(<1log10)远低于本研究中观察到的水平，暗示其可能在人类中具有疗效。

为了进一步评估turbinmicin的临床实用性，作者也评估了它对三氮唑耐药的丝状病原真菌A. fumigatus的疗效(菌株F11628,CYP51 G138C突变株，泊沙康唑的MIC为8mg/mL,turbinmicin的MIC为0.03mg/mL)(表S2)。这种病原体用现有的抗真菌药物难以治疗，导致死亡率很高(大于50%)。在体内模型中，作者选择了中性粒细胞减少和皮质类固醇免疫抑制的侵袭性肺曲霉菌病小鼠模型，通过定量聚合酶链反应(PCR)测量肺部真菌数量来评估治疗反应。在为期4天的治疗周期中，每6小时给感染病原菌的小鼠注射turbinmicin。在这些研究中，作者根据经验选择了较低的turbinmicin剂量范围(0.25至1 mg/kg)，因为与C. auris相比，A. fumigatus的MIC较低。同样，turbinmicin产生了剂量依赖性的真菌数量减少，每6小时给予1mg/kg处理的小鼠肺曲霉菌量下降了1.5log10 CFU (图2E)。在为期4天的治疗期间，所有的小鼠在16次turbinmicin注射后看起来都是健康的。而使用临床推荐的三氮唑(泊沙康唑)治疗时，剂量与人体暴露剂量相近，与已知的唑类耐药性一致，三氮唑对肺曲霉菌病小鼠无效。

图2 Turbinmicin在体外和体内显示出对多种多重药耐药真菌病原体的有效性和哺乳动物的安全性。(A)   Turbinmicin对39株真菌的体外抗菌活性。(B) Turbinmicin对C. auris B11211的时间-杀灭曲线。(C)用溶血法测定turbinmicin对红细胞的毒性。(D)使用念珠菌病小鼠模型进行多剂量Turbinmicin抗C. auris的体内实验。(E)采用肺曲霉菌病小鼠模型进行多剂量Turbinmicin抗A. fumigatus的体内实验。

作者使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) DNA条形码敲除和敲低文库研究了turbinmicin发挥活性的机制（MOA）。对于必需基因，作者利用mRNA扰动(DAmP)减少丰度的方法构建了敲低文库(约1000个基因被敲低)，通过对5’未翻译区进行修饰，使相应的mRNA转录本失稳，所有必需基因都被有效敲低。同时，作者评估了turbinmicin在非必需基因突变的特征性DNA条形码敲除文库(310个敲除)中的作用。用turbinmicin(1~5mg/mL)作用后，提取基因组DNA，多重PCR扩增条形码，Illumina测序确定扩增序列。在每种浓度下的化学遗传图谱显示，DAmP突变株对turbinmicin最敏感。作者发现sec14在5个测试浓度中的3个浓度下，化学-遗传相互作用具有显著的负相关(图3A)。Sec14p由SEC14编码，是跨高尔基体网络动力学所必需的磷脂酰肌醇-磷脂酰胆碱转运蛋白。Sec14p是一个有效的抗真菌靶点，目前没有任何被批准的抗真菌药物以Sec14p为靶点。

Turbinmicin与Sec14p的磷脂结合口袋对接产生了主要的结合模式，Turbinmicin的七环系统与吡啶甲酰胺(6F0E)和b-辛基葡萄糖苷(1AUA)的共晶配体位置有重叠，Turbinmicin的多烯尾部延伸到由共晶配体留下的疏水裂隙中(图S24)。这一观察结果与实验结果是一致的，在实验中，Turbinmicin侧链的断裂(通过水解)降低了其抗真菌活性(见补充材料)。与化学基因组学、单倍剂量不足和膜转运分析一样，研究结果表明Sec14p是Turbinmicin利用的主要抗真菌靶点，是其MOA的基础。

图3 Turbinmicin的MOA假说。Turbinmicin对酿酒酵母DAmP必需基因库(A)和特征的非必需基因库(B)的剂量化学遗传图谱。(C)使用敏感的、非必需的基因突变体构建的TransposeNET遗传相互作用网络。(D) Turbinmicin对C. albicans野生型和突变株的时间-杀灭曲线。(E)在存在和不存在3 mg/mL的Turbinmicin时，GFP-Snc1(绿色)相对于高尔基膜(红色)的定位图像。

世界卫生组织和美国疾病控制和预防中心最近的报告强调，正在出现的抗菌素耐药性是一场公共卫生危机。美国疾病控制与预防中心首次将真菌病原体C.auis列为最高优先级的紧急风险。抗真菌药物发展的一个主要挑战是确定它们在人体内的安全性以及逃避或阻止新的耐药性机制的产生。例如，棘白菌素（echinocandins），尽管其具有有效性和一般优良的安全性，但其本质上倾向于产生与隐球菌有关的耐药性;这种易感性是一个主要的限制，并凸显出改进方法的必要性。两性霉素和唑类药物都有其特点，但都受到毒性问题的限制。由于对CYP450酶的亲和性，唑类化合物特别容易受到药物相互作用产生的毒性的限制。对turbinmicin的潜在毒性的研究是必要的，但目前为止小鼠模型的实验结果良好。作者的数据表明Sec14p是抗真菌药物turbinmicin的主要靶点；潜在的脱靶效应似乎是有限的，并且没有下游毒性。在进一步开发为人类用药之前，仍需要仔细注意监测与真菌病治疗类似的更长期治疗(通常为2至6周)的不良反应，以及对其他动物物种的研究。

作者的研究结果表明，动物微生物组中具有的细菌多样性，很容易通过编码以前未测试过的天然产物的生物合成基因簇(BGC)的形式转化为化学多样性。这些化合物可以使用不同于目前药物的MOAs来对抗微生物病原体。Turbinmicin以其高度官能化的多环核和亲脂侧链构成了这样一个化合物。与turbinmicin相关的BGC类型很罕见(补充材料和图S21和S22)。turbinmicin的治疗潜力证明了微生物指引源头药物发现的重要性，特别是考虑到我们现在对微生物群的进化选择和生态系统以及尖端应用方法的有限的了解。抗真菌的体外和体内活性，哺乳动物的安全性，以及Sec14p作为靶点的开发前景，都为turbinmicin作为抗真菌先导物的进一步临床前开发提供了依据。

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