编译：厚朴，编辑：小菌菌、江舜尧。

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横跨美国东海岸地区，沿着自然的大气N沉降梯度，我们对7个成熟的阔叶混交林进行取样（表1）。总的自然N沉降范围从3.2到12.6 kg ha^-1yr^-1。年平均温度从5到11℃，年平均降雨量从1082到1473 mm yr^-1。选择的地点有类似的植物群落和非生物因子。7个地点中有5个进行了长期的模拟N沉降实验。2个实验进行随机的样方设计，3个实验地进行配对的实验设计。还有两个地点没有进行N添加实验，但是代表着最高的自然N沉降。我们在2017年7月对7个地点的土壤分别进行取样。

表1：每个地点的详细信息

通过高通量测序测定了真菌的群落组成；通过目标探针富集的方法我们测定了三种编码水解酶的功能基因，三种编码氧化胞外酶的基因，和四种编码蛋白质的基因，被认为具有普遍的胁迫耐受性。测定生物化学指标有：土壤含水量、土壤pH、质地、土壤全碳和全氮，碳和氮矿化和真菌生物量。

在自然的N沉降梯度上，我们分析了真菌的效应值对模拟N沉降的响应。真菌生物量，丰富度以及功能基因对N沉降的效应值根据响应比的对数值计算得出。

1 在自然N沉降梯度上真菌群落和土壤生物地球化学的变异

在自然的N沉降梯度上总的真菌生物量没有变化，但是在研究点之间群落组成存在显著不同（图1）。真菌群落组成与N矿化（图1），真菌分解编码基因（图1）以及耐逆编码基因（图1）的相对丰度显著相关。拥有最高的自然N沉降水平的样地的群落组成与耐逆编码基因的相对丰度相关性更高，然而自然N沉降最低的样地与分解相关的编码基因的相对丰度相关性更高。Shannon指数下降，但是分类单元丰富度随着环境的N沉降没有变化。

图1 沿着N沉降梯度每个样地对照样方中真菌分类单元组成。每个点代表组成的均值，棒代表标准误。颜色梯度代表环境N沉降梯度从低（红色）到高（红色）。向量呈现了真菌群落组成和N矿化以及分解和忍耐胁迫功能基因相对丰度之间显著的关系。

在氮沉降低的地方，真菌群落组成的指示分类群是外生菌根（ECM），在氮沉降高的地方，指示分类群主要是腐生的真菌。几个真菌指示类群只在环境氮沉降梯度的两端被发现（图2）。在低的N沉降（4-4.9 kg N ha^-1 yr^-1）地点中ECM分类群是唯一发现的指示类群，包括Russula, Cenoccocum, Elaphomyces, Cortinarius, 和Sebacina。在大于11 kg N ha^-1 yr^-1的样方中，指示类群是腐生真菌，并伴随着一些ECM。在对照样方中沿着自然的N沉降梯度ECM的相对丰度降低（图2a），而腐生真菌没有变化（图2a）。沿着梯度，ECM和腐生真菌相对丰度的比值也没有变化（图2a）。

图2 在对照和模拟N沉降（施肥）处理中代表不同门的（a）和功能群（b）的土壤真菌相对丰度。地点按照自然的N沉降从低到高排序（从左到右）。

沿着自然的N沉降梯度在对照样方中功能基因组成和相对丰度发生了转变（图3和6）。20000个功能基因变体的组成在自然的N沉降和土壤CN比中显著不同。每种功能基因分组包含几十到上千的不同的基因变体。在功能分组水平，我们发现组中的相对丰度对自然的N沉降响应不同（图4）。编码水解酶基因的相对丰度与自然的N沉降呈现中性或者正相关。编码氧化酶基因的相对丰度与自然的N沉降显著负相关。一种编码抗逆蛋白的基因的相对丰度与自然的N沉降正相关，其它三种抗逆蛋白编码基因与自然的N沉降不相关（图4）。

图3 基因变体组成和自然的N沉降以及土壤CN比之间的关系。每个点代表一种基因（例如，lipH）或者基因族（例如，多铜氧化酶），并且颜色代表广泛定义的基因群：水解酶，氧化酶和耐逆基因。在所有样地，自然的或者对样方中点是基于基因的相对丰度计算得出的。点越近代表基因变体有更相似的组成。

图4 每个功能基因的相对丰度和自然的N沉降水平之间的皮尔森相关系数。水解酶编码基因，氧化酶编码基因以及耐逆基因在分组中陈翔。星号代表显著性水平（*p < .05; **p < .01; ***p < .001）。

2 在自然的N沉降梯度上N肥处理效应

总体而言，真菌生物量和群落结构随着N肥添加没有差异，施肥处理对这些参数的影响在不同的梯度上不同。在自然的N沉降低的地方，真菌生物量随着肥料的添加而增加，然而在自然的N沉降高的地方，随着肥料的添加而降低（图5a）。在低海拔地区，真菌的生物量随着施肥处理而增加，在高海拔地区随着肥料处理降低。同样，OTU丰富度对肥料添加的响应在不同的N沉降梯度上不同（图5b）。在自然的N沉降低的地方（<6 kg N ha^-1 yr^-1），丰富度随着施肥处理增加，在自然的N沉降最高的地方（>10 kg N ha^-1 yr^-1），丰富度随着N处理降低。在对照和施肥的样方中ECM的相对丰度是相似的，并且对施肥的响应也不与自然的N沉降梯度相关。同样，在对照和施肥样方中，腐生的分类群在对照和施肥样方中有相似的相对丰度，并且对施肥的响应与自然的N沉降不相关（图2a）。

图5 在自然的氮沉降梯度上真菌生物量（a）和真菌可操作分类单元丰富度对施肥的响应。每个点代表5个实验研究地点中真菌生物量或者丰富度在施肥样方中相对于对照样方中的比值（自然的N沉降从最低到最高：NY1，ME，MA，NH和WV）。阴影部分代表95%的置信区间。

不同功能基因组相对丰度对肥料处理的响应处决于自然的N沉降（图6）。编码氧化酶基因的相对丰度随着施肥处理降低，效应值随着施肥处理和pH增加（图6a），随着海拔降低。编码水解酶的基因的相对丰度随着施肥处理倾向于增加，但是在自然的N沉降之间的响应没有差异（图6b）。功能基因的丰度改变了，但是施肥处理在自然的N沉降梯度上没有改变基因变体的组成。施肥处理对编码抗逆蛋白基因的相对丰度没有影响（图6c）。施肥处理和自然的N沉降对功能基因的组成没有显著的交互作用。

图6 编码氧化酶（a），水解酶（b）或者耐逆基因相对丰度沿着自然的N沉降变化。水平的灰色虚线表示N添加相对于对照样方有同等的响应。趋势线周围灰色面积代表95%的置信区间。

本研究首次在大的空间尺度，自然的大气氮沉降梯度和联网的肥料添加实验中，记录了真菌群落以及潜在的真菌功能的响应。我们发现土壤真菌群落和潜在的功能对肥料处理的响应取决于自然的N沉降，这可能帮助解释了为什么地下对N添加的响应常常在数量级上有所不同。尽管总的真菌生物量在自然的或者模拟的N沉降下没有差异，但是在N沉降梯度上群落组成高度不同，并且群落的非相似性不能被纬度解释。值得注意的是，在自然的N沉降高的地方的真菌群落与分解相关的基因的相对丰度负相关，与抗逆相关基因的相对丰度正相关。在自然的N沉降水平低的地方，群落组成可能是通过选择能分解有机质获得无机氮的类群来驱动的。在自然的N沉降高的地方，选择压力可能包括增加的富营养化和酸化，以及微量元素的限制。因此，在自然的N沉降梯度上真菌群落的组成和功能不同，基于N沉降水平，N肥对真菌群落的影响是可以预测的。在自然的N沉降较高的森林中，施肥处理降低了真菌生物量和OTU丰富度，然而在自然的N沉较低的森林中，施肥增加了它们。此外，编码氧化酶的基因随着自然的N沉降的增加而降低，而编码水解酶的基因随着自然的N沉降的增加而增加。只有一种抗逆基因的相对丰度随着自然的N沉降梯度而增加（图4）。综上所述，我们的结果表明，真菌对肥料添加的不同响应可能是由于在自然的N沉降低的地方减轻了N对真菌的限制，而在环境氮沉降高的地方，施肥处理引起了生理胁迫。

真菌群落组成在自然的N沉降梯度上是高度不同的，与N矿化和分解以及抗逆基因的丰度相关联。之前就有研究记录了真菌群落对N添加的响应，具有较低分解能力的分类群丰度增加。我们检测到施肥处理增加了白腐真菌的相对丰度，一种拥有分解木质化有机质的真菌类群，而编码氧化酶的基因我们观测到了相反的格局。总而言之，这些结果强调了研究功能基因的重要性，除了分类上的转变，真菌类群相对丰度的转变不总是与实际的功能潜力一致。随着N沉降分解潜势的变化与之前的发现类似，并且可能与减少的编码氧化酶的基因丰度相关，或者这些基因的下调。然而，分解速率可能进一步取决于是否选择真菌群落进行抗逆。假设微生物群落在分解和耐逆响应之间进行权衡，那我们的结果表明高的自然N沉降支持抗逆性超过了分解。在本研究中我们测定了总的土壤有机碳，但是我们猜想颗粒有机碳可能很少分解，由于具有较弱分解能力的抗逆真菌类群的筛选，而矿化有机碳可能会减少，因为胁迫耐受性会降低微生物的生长效率。选择耐胁迫真菌是了解长期施氮条件下温带森林土壤有机碳积累的一个新视角。

N沉降影响真菌群落组成，即使是在复杂的环境梯度上，伴随大的空间异质性。我们发现在自然N沉降低的地方，ECM是群落组成的指示信号，在自然的N沉降高的地方，腐生真菌是主要的指示信号。在自然的N沉降梯度上，一半的指示物种是ECM，支持ECM对氮沉降尤其敏感的观点。ECM具有形态可塑性，因此在不同的条件下都有调整探索策略的能力，对N沉降和其它的环境压力有积极的响应。在区域空间尺度上，许多ECM分类群具有地方特性并且我们的结果表明在低的N沉降的地方，ECM对N沉降尤其敏感，而在高的N沉降下，可能会选择一系列的腐生真菌。ECM分类单元的丢失，和腐生真菌类群的获得会改变群落组成。ECM和腐生真菌的变化对区域尺度上的beta多样性有重要的作用。

在自然N沉降低的地方，N肥添加增加了真菌生物量和OTU丰富度，然而在自然N沉降高的地方，N肥处理减少了真菌的生物量和丰富度。在自然N沉降低的森林中，我们假定真菌生长和活性受N有效性的限制，实验处理的N添加缓解了这种限制。背景N沉降与本研究中的具有可比性的其他长期实验中发现分解速率与N的有效性正相关。在背景N沉降低的森林中增加N会选择不能忍受低的N有效性的分类群，解释了我们所观测到的真菌丰富度的增加。

另一方面，在自然N沉降高的地方，N添加减少了真菌生物量和丰富度。我们猜想在环境氮沉降较高的地点，由于施肥后生理胁迫超过阈值，真菌生物量和丰富度降低。无机氮能酸化土壤，我们发现相对于低的自然N沉降的地方，在高的自然N沉降的地方土壤pH酸性更强。N沉降引起的土壤酸化会减少微生物生长，进而减少微生物生物量。除了土壤酸化，N沉降引起的微量元素的限制可能也会引起真菌的生理胁迫。例如，N添加会加剧锰的限制，锰对于真菌胞外酶的产生是关键的，尤其是与木质素分解相关的。我们的研究结果表明，在土壤氮负荷较高的地方，真菌生物量较低，可能会导致分解速度减慢，因为真菌被推到了胁迫阈值之外。

具有分解特征的功能基因对自然的N沉降的响应不同。随着自然的N沉降梯度，编码氧化酶的基因减少，然而编码水解酶的基因增加。编码氧化酶的基因组成比编码水解酶或耐逆酶的基因组成更受限制。我们研究的真菌功能基因的一半与自然N沉降显著相关。自然的N沉降与CBD（水解酶），MNP（氧化酶）和RNA解旋酶（应激耐受蛋白）关系最强。之前就有报道氧化酶活性会随着N沉降减少，并且我们的研究证实了前人的工作，即高N沉降降低了氧化酶产生的遗传潜力。我们证明了氧化和水解基因丰度变化的遗传联系，这与氮添加试验引起的酶活性变化有关，这对生态系统土壤碳储存有影响。我们强调，我们的研究证明了酶功能的遗传潜力；基因组成的变化并不总是与可测量功能的变化相关。环境氮沉降导致的氧化酶编码基因的减少可能与氧化有机质的真菌类群的减少以及施氮后有机质的积累有关。

尽管耐逆基因变体的组成与高氮沉降的真菌群落组成特征有关，但耐逆相关的蛋白质编码基因的总相对丰度与氮沉降没有直接关系。其中一个抗逆基因RHEL与环境氮沉降相关。RNA解旋酶在耐寒性中很重要，因为它阻止RNA结构的形成进而影响翻译。RNA解旋酶可能是一个普遍的非生物胁迫反应系统的一部分，它重新排列RNA二级结构以影响生化级联。这仍然是一个活跃的研究课题，许多关于真菌如何耐受非生物胁迫的研究仍然是未知的。在真菌中使胁迫耐受的一系列性状可能对氮沉降作出响应，但我们有可能针对的是过于笼统的胁迫耐受性状来解释赋予氮沉降抗性的胁迫响应基因的全部目录。关于真菌的胁迫耐受性知之甚少，并且在需要发展的靶向基因富集探针的数据库中，真菌耐胁迫基因很少。在未来的研究中，我们建议靶向研究真菌怎样响应N沉降胁迫。N沉降引起的胁迫与土壤酸化相关，因此编码质子泵的基因可能更丰富（例如，谷氨酸脱羧酶）。N沉降也会改变微量元素的有效性，进而影响真菌分解能力和群落组成。参与获得微量元素的酶的基因能够阐明微量元素的限制是否真菌群落和功能随着N沉降的转变相关。然而，真菌分解对N沉降的响应已经做了很多工作，但是抗逆对N沉降的响应研究的还很少。我们猜想结合特定真菌群落观察到的分解减少和胁迫耐受能力增强的组合协同调节了生态系统C库对氮沉降的响应。

总而言之，我们的研究揭示了土壤生物化学和真菌对N添加的响应取决于背景的自然N沉降水平。在自然N沉降低的样地（<6kg ha⁻¹ year⁻¹），真菌生物量和丰富度随着施肥处理增加，而在自然的N沉降高的地方（>8 kg ha⁻¹ year⁻¹），真菌生物量和丰富度随着施肥处理而减少。在不同的自然N沉降梯度上发现了不同的真菌群落，在低的自然N沉降样地，ECM是指示类群，在高的自然N沉降样地，腐生真菌是指示类群。随着自然的N沉降梯度，编码氧化酶的基因减少，而编码水解酶的基因增加。我们并没有发现增加胁迫耐受性编码基因相对丰度的证据，这就需要进一步关注与氮添加诱导的胁迫更相关的特定胁迫响应系统。无论是在真菌分解还是在肥料处理或环境氮沉降条件下，编码基因的耐逆性之间是否存在权衡仍然是一个没有定论的问题。

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