编译：萌依依，编辑：木木夕、江舜尧。

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1 比较（同一笼）水体和斑马鱼肠道微生态群落，分析构建的三种水环境中对鱼肠道微生物群的初始组装影响。

2 12 dph（孵化后的发育天数）后，对斑马鱼进行环境转换（换笼），以检验环境扩散对肠道微生物群演替的影响。

3 研究发育阶段、环境、变迁和食物对斑马鱼肠道微生物群演替的定性和定量贡献。

4 斑马鱼肠道微生物群生态演替的生态过程分析，探讨了斑马鱼发育过程中肠道微生物群生态演替的机制。

1 为操纵斑马鱼建造不同水环境

为了研究周围环境对肠道微生物群初始定殖和后续演替的影响，我们构建了三种不同的水环境来操纵斑马鱼(图1)。具体来说，A、B两个环境分别种植了香菇草和黄金葛，并将它们的根保存在水中，以便在植物和水之间交换物质；C环境中没有种植植物。三种环境A、B、C的水化学因子差异显著 (p<0.05)。具体来说，环境A的叶绿素a（Chl-a）和总有机碳 (TOC) 浓度最高，而环境B的可溶性正磷酸盐 (SOP)、NH₄-N和NO₂-N浓度最高，环境C的NO₃-N浓度最高 (图2a)。环境A和环境B的微生物丰富度和系统发育多样性 (PD)显著高于环境C (p<0.05)，而环境A的Shannon多样性指数显著高于环境B和C (p<0.05，图2b)。此外，Venn图表明，三种环境中微生物OTUs的组成有很大的不同：只有3.0-14.5%的OUTs是两个或三个环境共同所有，而63.7%的OTUS是唯一的OTUs (图2c)。三种水环境通过丰度加权的DCA排序有明显的区分 (图2d)。因此，可以预见，此构建环境将为定植鱼类肠道微生物群提供独特的微生物种质库。

图1测试宿主和环境对斑马鱼发育过程中肠道微生物生态演替影响的实验装置。斑马鱼在三种不同的环境(A、B和C)下被操纵。首先，将属于同一亲缘关系的斑马鱼胚胎孵化在三个独立的圆盘中，分别用来自A、B和C环境的水孵化。其次，从不同环境中孵化出来的斑马鱼(分别用绿色、红色和蓝色表示)在孵化后12天(dph)从盘子转移到水箱，并在小网箱(虚框)中饲养。

图2三种构建的水环境的化学和微生物特征以及12 dph时定居的斑马鱼肠道微生物群。a水的化学因素。用标准差绘制平均值，用方差分析(ANOVA)中的最小显著性差异(LSD)检验不同环境之间的差异。不同字母表示不同环境之间存在显著差异，而同一字母表示没有显著差异。Chl-a叶绿素a、SOP可溶性正磷酸盐、TOC总有机碳。b α-水和肠道微生物的多样性。PD系统发育多样性。c水微生物的维恩图。维恩图表示跨环境共享的OTU(操作分类单元)占在所有环境中检测到的OTU总数的比例，但它不提供有关OTUs的定量数据。d 12 dph时水和肠道微生物群差异的去趋势对应分析。

2 斑马鱼肠道微生物群在原始环境中的组装和周转

为了测试不同的水环境对斑马鱼肠道微生物群的初始组装影响，我们分析了水和肠道微生物群落以及它们之间的关系。首先，我们发现同一批在不同环境中孵化的斑马鱼胚胎在12 dph时聚集了相似的肠道微生物群落，这在基于Bray-Curtis距离的DCA排序中是无法分离的 (图2d)。在环境A、B和C中孵化的斑马鱼在PD、丰富度和Shannon 指数(图2b)的α多样性也没有显著差异 (p>0.05)。然后，我们进一步探讨了水环境是否会影响斑马鱼中已建立的肠道微生物群的周转。具体来说，在肠道和水样平均丰度>1%的类群只有3种OUT (OTU_1：Cetobacterium、OTU_3：Cetobacterium和OTU_4：Aeromonadaceae，其详细分类见补充表1)；在肠道样本中检测到的大多数OTUs在水样中含量不高 (图3a)。根据Bray-Curtis距离分析，根据鱼类发育阶段(即12-20、27-42和56-98 dph，补充图1)，每个原始环境中饲养的斑马鱼的肠道微生物群可被清楚分开。肠道微生物群的前20个OTU解释了39.7-43.1%的群落变异，也显示出鱼类发育阶段的明显差异(图3b)。

在每个原始环境 (即1、5、9笼)中，斑马鱼肠道中的优势OTU也表现出相似的演替模式。具体地说，在12 dph-20 dp时，斑马鱼的OTU_5 (Vibrio)和OTU_4 (Aeromonadaceae)的丰度相对较高，共占微生物丰度的50.0% (补充图2a)。在27 -42 dph时，OTU_2  (Plesiomonas)占优势 (16.2-26.7%)，而OTU_5 (Vibrio)仅占总丰度的5.0-5.8%。然而，OTU_4 (Aeromonadaceae)在12-42 dph期间始终保持较高的丰度(10.6-31.4%) (补充图2a)。在56-98 dph时，两个Cetobacterium成员(OTU_1和OTU_3)显著增加，占总丰度的40.0%，而OTU_4 (Aeromonadaceae)减少到8.2-11.0% (补充图2a)。然而，在水环境中相对较高的OTU(如OTU_7和OTU_11的Flavobacterium成员，补充图2b)，从理论上讲有很高的机会通过环境扩散进入肠道，但并没有成为肠道生态系统中的优势类群。相反，水中低丰度的微生物成为斑马鱼肠道中的大量定殖者，但依赖于宿主的发育。因此，无论是肠道微生物群落组成，还是斑马鱼肠道中优势OTU的丰度，都表现出明显的发育阶段特异性。

图3每个检测到的OTU的平均丰度和前20个OTUs解释的肠道微生物群落的变化。a水和肠道微生物群中每个OTU的平均丰度。在肠道和水样中同样丰富的微生物OTU沿对角线下降，而在水或肠道样本中富集的微生物OTU则分别落在这条线的上方或下方。虚线分别标出肠道和水样中平均丰度>1%的OTUs，分别以蓝色和红色表示。红色和蓝色混合点表示肠道和水样中占优势的OTUs，黑点表示肠道或水样中平均丰度<1%的OTUs。b典型对应分析 (CCA) 显示由前20个OTUs解释的肠道微生物群变化。每个点代表了单个斑马鱼的肠道微生物群落，箭头代表了排名前20位的细菌OTUs的贡献。

3 斑马鱼环境转化后肠道微生物群演替

在12 dph后，对部分斑马鱼进行配对的环境转换，以进一步检验环境扩散对肠道微生物群演替的影响。我们试图回答两个问题：(i)斑马鱼在相同的环境中孵化，但在不同的环境中饲养，是否会表现出不同的演替模式？(ii)在不同环境中孵化但在同一环境中饲养的斑马鱼是否有相似的演替模式？我们的结果表明，肠道微生物群落的生态演替主要与斑马鱼的发育阶段有关，与斑马鱼的孵化环境 (图4a) 或饲养环境历史 (图4b) 无关。斑马鱼肠道微生物群落可明显地分为三个阶段 (即12-20、27-42和56-98dph，图4) ，分别对应于三个发育阶段 (即12-20、27-42和56-98dph，图4)。不同的检验可以进一步证实这一点(PERMANOVA，p<0.05，表1)。然而，任何阶段在原始环境 (笼子1、5、9) 和切换环境 (笼子2、3、4、6、7、8) 中的斑马鱼之间的分析没有显著差异 (p>0.05，补充图3和补充表2)。当我们研究所有水箱中的斑马鱼以测试整体环境分散对肠道微生物群演替的效应时，也观察到了类似的阶段特定模式(表1和补充图4a)，但没有环境特定模式(补充表2和补充图4b)。

此外，各阶段的肠道微生物群落与相应的水体微生物群落也存在显著差异 (p<0.05，补充表3)。斑马鱼肠道微生物群在环境转换后的演替模式与原始环境相似，也将7个时间点划分为3个阶段。因此，孵化环境和环境变迁对斑马鱼肠道微生物群演替没有显著影响，这似乎主要由寄主发育决定。

表1.斑马鱼不同发育阶段肠道微生物群落差异的置换多变量方差分析(PERMANOVA)。

图4非趋势化对应分析(DCA)显示了环境对斑马鱼发育过程中肠道微生物群演替的影响。a孵化环境的影响。b饲养环境的影响。不同环境下孵化的斑马鱼(Env)或在不同环境中生长，在寄主发育过程中表现出相似的肠道微生物演替模式。

4 寄主发育决定了斑马鱼肠道微生物群的生态演替

由于孵化环境和环境变迁对斑马鱼肠道微生物群的组装和演替没有显著影响，因此我们随后重点研究了不同因素(即发育阶段、环境、变迁和食物)对斑马鱼肠道微生物群演替的定性和定量贡献。多元回归树 (MRT) 分析解释了68.3%的微生物多样性变异 (图5a)。其中，肠道微生物群多样性的估计值首先按发育阶段划分 (46.2%)，这是影响肠道微生物群多样性和演替的最重要因素，而水环境在早期阶段只能解释较小比例的变异(12dph时为1.4%，27-42dph时为1.8%)。

Shannon指数、系统发育多样性（PD）和丰富度(图5b)的α多样性在不同发育阶段之间也有显著差异(p<0.05)。一般线性模型 (GLM) 分析表明，发育阶段是形成α-多样性的唯一显著预测因子 (p<0.05，补充表4)。PD、丰富度或Shannon指数的变异主要受发育阶段的影响 (r2=33.445.9%，p<0.001)，环境对丰富度的贡献率仅为3.4% (p<0.05)，而过渡期和食物对丰富度的解释不显著 (p>0.05)。使用Bray-Curtis距离和Jaccard距离进行的Mantel检验表明，发育阶段是显著影响β多样性的最强因素 (r>0.50，p<0.001)。使用部分Mantel检验在控制环境/过渡/食物的影响一致时，评估了多样性矩阵与发育阶段之间的相关性，(r> 0.5，p<0.001，表2)。然而，过渡与β多样性没有显著的相关性 (p>0.05)，环境和食物与β多样性仅显示出弱的相关性 (|r|≤0.2) (补充表6)。因此，斑马鱼的发育阶段是肠道微生物群演替的主要预测因子，超过了环境、过渡期和食物的演替阶段。然而，我们承认在这里没有探讨母体/绒毛膜变异作为肠道微生物群变异因素的影响。

表2.肠道微生物群(M)和发育阶段(S)之间相关性的Mantel和部分Mantel测试的汇总统计数据。

图5斑马鱼肠道微生物多样性主要与发育阶段有关。a在不同因素（发育阶段、环境、变迁和食物）交互作用下，基于Bray-Curtis距离进行多元回归树 (MRT) 分析。b用标准误差法绘制了α多样性的Shannon指数、系统发育多样性 (PD)和丰富度。不同环境之间的差异通过方差分析和最小显著差异 (LSD) 检验来检验。不同字母表示不同环境之间存在的显著差异，而同一字母表示不同环境之间没有显著差异。

5 斑马鱼肠道微生物群演替的生态过程

通过对斑马鱼肠道微生物群生态演替的生态过程分析，探讨了斑马鱼发育过程中肠道微生物群生态演替的机制。我们发现，每个水箱内的生态系统多样性(γ_Ecosystem) 对多样性的不同部分表现出相似的贡献。具体地说，复合群落主要由水体或肠道生境的平均多样性贡献 (β_{intra-Habitats}，39.8-53.9%，图6a)，表明肠道微生物群也是生态系统微生物多样性的重要贡献者。相比之下，每个水体或肠道样本的平均多样性 (α_{Local-Communities})和水体与肠道生境之间的多样性总和 (β_{inter-Habitats})分别占总体多样性的24.8%-29.2%和20.8%-34.3% (图6a)。零模型检验还表明，斑马鱼发育阶段中观察到的群落相似性与随机排列群落的相似性显著不同(p<0.05)，表现出相对较高的确定性比率(补充表7)。量化的生态过程证实斑马鱼肠道微生物群落的演替受强烈的确定性过程支配 (图6b)。同质选择是肠道微生物变异的28.2%-40.8%，并随着寄主发育的增加而增加。同质选择使群落组成在一致的环境条件下趋于相似。结果表明，同质选择对肠道微生物变异的贡献率为28.2%-40.8%。造成不同环境条件下群落组成不同的异质性选择对变异的贡献率为4.4-8.4%。相比之下，早期的均质分散也很重要 (20.5%)，但在整个鱼类发育过程中，分散限制的贡献要小得多 (只有0.6-2.0%) (图6b)。因此，斑马鱼肠道微生物群演替主要受到阶段性选择支配，均匀化扩散仅在早期阶段起重要作用。

图6元群落多样性和生态过程的量化。a元群落多样性在多尺度上的等级划分。每个水箱或所有水箱的生态系统多样性 (γ_Ecosystem) 被划分为α_{Local-Communities} (每个水或肠道样本的平均多样性)、β_{intra-Habitats} (水或肠道生境内多样性的平均值)和β_{inter-Habitats} (水和肠道生境之间的多样性总和)的贡献。b控制肠道微生物群落的量化的主要生态过程。百分比(单条上的数字)给出了每个已知过程在不同阶段对群落演替的相对贡献，其余部分归因于非支配过程。

了解鱼类肠道微生物群的生态演替及其潜在机制有助于理解宿主新陈代谢、健康和环境适应，因此已成为肠道生态学的中心主题。本研究阐明了在不同水环境下，鱼类肠道微生物群在宿主发育过程中组装和演替的主要因素。我们发现，肠道微生物群主要由寄主发育决定，而不是由孵化环境或环境转变决定。我们的研究结果支持我们的假设，即由于宿主遗传学、免疫学和肠道营养生态位的原因，宿主发育将压倒环境扩散，从而控制鱼类发育过程中肠道微生物群落的演替。

宿主遗传学被认为是提供肠道微生物初级选择的最重要的力量。通过对凤尾鱼短时间(12天)的监测，发现鱼肠道微生物主要由与水微生物无关的确定性寄主效应驱动的。许多其他研究也表明，不同鱼种的肠道微生物群落因寄主遗传或系统发育不同而有很大差异，尽管寄主种源和驯化状况有很大差异，但核心肠道微生物群可以在同一鱼种中定居。此外，宿主亚基因组 (具有杂交鱼类谱系) 和宿主基因型 (种群间差异) 可能影响鱼类肠道生态系统中的微生物群落。

然而，这些研究总是集中在鱼的一个特定的较短的发育阶段。有趣的是，最近的研究表明，肠道微生物群可能是演替鱼类的发育推动的最重要因素之一。例如，Burn等人发现随着宿主的发育，斑马鱼肠道微生物群落组装的非中性过程的相对重要性增加。因为同质选择的确定性过程随着鱼类的发育而增加，以组装肠道微生物群。这些研究和其它研究开启了理解鱼类肠道微生物群的新纪元，因为微生物群落的多样性和组成在斑马鱼的发育过程中是不同的。我们先前的研究还表明，水产养殖鱼类(如草鱼、中华鲟和南方鲟)可以再孵化后3天组装各自的肠道微生物群落，随后是鱼类发育的阶段特异性模式，这与其他动物(如虾、昆虫鸟老鼠和人)在宿主发育过程中微生物群落的更替是一致的。因此，关于肠道微生物的各种研究之间的有效比较至少应该努力使用一致年龄的宿主。

本研究旨在通过综合寄主发育、孵化环境和环境转换的影响，进一步了解肠道微生物群的组装和演替。我们发现斑马鱼的发育对肠道菌群的影响比环境的影响要大得多。观察到的特定阶段肠道微生物群演替格局可归因于三个方面。

首先，肠道微生物在斑马鱼体内的定植最初大约发生在斑马鱼受精后第三天。此时，卵黄囊几乎被消耗殆尽，幼虫开始进入外部食物，同时在不同的微生物物种中定居。被定植的微生物反过来可以进一步促进斑马鱼的肠道发育。这意味着在斑马鱼发育过程中，肠道微生物的辅助作用可能会有所不同，特别是在器官发育期，从而表现出阶段特异性的肠道微生物群。其次，宿主免疫力也被认为是影响鱼类肠道微生物群的重要因素。虽然斑马鱼早期阶段(如18dph之前)的先天免疫对肠道微生物的多样性只有很小的影响，但它们的适应性免疫增加了肠道微生物群落中选择性过程的作用。在这项研究中，斑马鱼肠道微生物群的演替在12-20和27-42 dph之间表现出明显的分裂。第三，寄主相关的微生物也可以从它们的宿主中受益，不同的发育阶段宿主内的生态位会有很大的不同，它们具有受保护的和营养丰富的生态位。因此，肠道微生物群的聚集在很大程度上是由宿主饮食和分泌物所创造的营养情境驱动的。

我们发现，同质选择是控制肠道微生物群的主要确定性过程，但母体/绒毛膜变异作为影响肠道微生物群变异的一个因素在此没有进行探讨。此外，斑马鱼的同质性选择随着斑马鱼的发育而增加，导致微生物群落相似，因为一个阶段内的肠道环境趋于相似。均质扩散只在早期阶段重要，因为新形成的肠道生态系统最初没有先锋物种来排他性地扩散其他微生物物种。

这与之前的研究一致，该研究表明中性过程在寄主发育过程中的相对重要性下降。它还解释了为什么斑马鱼幼体的微生物群落比成鱼的微生物群落更类似于环境群落。除了来自寄主的选择压力外，肠道微生物群和水体微生物群之间缺乏显著关系也可能是由于肠道和水体生境的不同条件造成的，这可能是由于异质选择过程导致群落组成不同所致。

与寄主对斑马鱼肠道微生物群演替的强烈影响相比，孵化环境或环境变迁对环境的影响要小得多。这与之前在斑马鱼和草鱼中的发现是一致的，表明肠道微生物群落与周围环境不同。其他一些水生动物的肠道微生物群落也与周围水域或沉积物中的微生物群落有很大不同。除了上面讨论的来自宿主的选择压力外，宿主间通过水的微生物传播也是帮助鱼类在不同个体中形成相似肠道微生物群的重要力量。

在本研究中，我们发现复合群落的总体多样性主要归因于肠道或水生生境内的平均多样性，表明肠道微生物对养殖生态系统的复合群落有重要的贡献。一般来说，寄主相关的微生物群在很大程度上受到肠道生态系统中影响微生物生存和持久性的因素的影响。

肠道生态系统中成功的移居者应该具有占据空间、获取资源和避免通过排泄物移走的特征的选择优势。它们在相对较高丰度的鱼类肠道中的定殖成功，由于与周围水体的不断沟通(即摄食和排泄)，反过来可以影响养殖系统的集合群落。综上所述，本研究试图解决宿主发育、孵化环境和环境转变对仔鱼到成鱼肠道微生物群演替的影响。

虽然母体/绒毛膜变异作为肠道微生物群变异的一个因素的影响尚未被探讨，但我们发现斑马鱼的发育阶段解释了肠道微生物群落和优势OTUs的生态演替。此外，由于寄主效应，斑马鱼肠道微生物群的生态演替主要由发育相关的同质选择决定，孵化环境和环境变迁对环境的影响要小得多。这些发现扩宽了目前关于鱼类发育过程中肠道微生物群生态演替的理解，也为其他水生动物的肠道生态学提供了新的见解。

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