aBIOTECH | 中山大学李剑峰团队开发富集多基因CRISPR突变体和剔除Cas9转基因的双功能筛选系统

CRISPR/Cas9作为一项革命性基因编辑技术，其介导的靶向基因敲除已经广泛应用于包括植物在内多种生物的基因功能研究。随着基因功能解析的深入，越来越多的生物学研究需要利用CRISPR/Cas9技术创制多基因突变体，但多基因共编辑效率较低导致突变体筛选鉴定工作费时费力。此外，为了避免Cas9基因长期存在造成的脱靶风险和方便后续转基因回补进行功能验证，剔除编辑突变体后代的Cas9转基因势在必行。目前解决这两个技术难题的策略分别依赖于不同的筛选报告系统。因此，亟需开发一套可同时实现高效富集CRISPR多基因敲除突变体和快速剔除Cas9转基因后代的筛选系统。

近日，中山大学生命科学学院李剑峰教授团队在aBIOTECH发表了题为“A dual-function selection system enables positive selection of multigene CRISPR mutants and negative selection of Cas9-free progeny in Arabidopsis”的研究论文。在该研究中，作者实现了利用D-氨基酸氧化酶（DAO）解除D-serine对植物的毒害作用同时将无毒的D-valine转化成有毒产物这一双重特性，结合CRISPR诱导的单链退火修复策略（SSA），开发了一套可高效富集CRISPR基因敲除突变体和快速剔除后代中Cas9转基因的双功能筛选系统。

作者首先在大肠杆菌Escherichia coli中评估了五种不同物种来源DAO对D-serine的解毒能力，发现来源于三角酵母（Trigonopsis variabilis）的TvDAO可赋予E. coli较强的D-serine耐受性（图1A）。作者在拟南芥中转基因表达TvDAO，进一步验证了TvDAO可实现D-serine正向筛选和D-valine反向筛选转基因拟南芥植株的设想（图1B和1C）。

图1. D-氨基酸氧化酶TvDAO可用于双功能筛选转基因拟南芥植株

另一方面，SSA策略是一种基于同源重组的DNA修复机制，可促进双链断裂两侧DNA重复序列之间的重组进而造成中间片段的删除（图2B）。由此，作者设计了一个包含由“TGATGA- hEfemp1 TS”靶序列间隔的TvDAO基因核苷酸重复序列（nt 280–788）的dTvDAO（dead TvDAO）报告基因，结合CRISPR/Cas9系统同时靶向介导SSA修复dTvDAO以及靶向敲除调控拟南芥表皮毛产生的三个内源基因CPC、TRY和ETC2（图2A和2B）。

PCR鉴定和Sanger测序结果显示，在使用D-serine筛选获得的T₁转基因苗中，失活的dTvDAO几乎均被SSA纯合修复成有功能的TvDAO，而且三个内源靶基因同时被编辑的概率高达92.6%；与此同时，使用潮霉素筛选获得的T₁转基因苗中，只有少量dTvDAO能被SSA成功纯合修复，且三基因共编辑的概率只有52.8%，表明TvDAO介导的筛选系统可以高效富集CRISPR多基因敲除突变体（图2C）。此外作者还证实，利用D-valine反向筛选可在T₂代多基因突变体中成功剔除Cas9和TvDAO转基因获得Transgene-free植株（图2D和2E）。

图2. TvDAO介导的CRISPR/Cas9双功能筛选系统设计及其效果验证

综上所述，该研究使用编码D-氨基酸氧化酶的TvDAO报告基因作为代理筛选标记，开发了一套在拟南芥中富集多基因编辑突变体和剔除Cas9转基因的双功能筛选系统。该双功能筛选方法包括五个步骤（图3）：（1）构建包含dTvDAO报告基因和共表达Cas9/gRNAs的双元载体；（2）农杆菌介导的拟南芥遗传转化；（3）使用5 mM D-serine正向筛选获得T1代转基因苗；（4）Sanger测序靶基因扩增子以确认存活T1植株中的多基因编辑情况；（5）使用15 mM D-valine反向筛选获得T₂代Cas9-free突变体植株。

图3. TvDAO介导的CRISPR/Cas9双功能筛选系统工作流程图

该研究得到了科技部重点研发计划项目和国家自然科学基金等项目的资助。中山大学生命科学学院副研究员王凤珠和硕士生鲍颖为本文的共同第一作者，中山大学生命科学学院李剑峰教授和副研究员王凤珠为共同通讯作者，该团队博士后黎镇祥和熊翔宇也参与了该研究。

引用本文：

Wang, FZ., Bao, Y., Li, Z. et al. A dual-function selection system enables positive selection of multigene CRISPR mutants and negative selection of Cas9-free progeny in Arabidopsis. aBIOTECH (2024). https://doi.org/10.1007/s42994-023-00132-6

作者简介

李剑峰，中山大学生命科学学院教授，博士生导师。2005年博士毕业于中山大学，2005年11月至2014年8月先后在美国田纳西大学做博士后和美国哈佛医学院/麻省总医院任助理研究员。2014、2015、2021年先后获得国家优秀青年科学基金、国家杰出青年科学基金资助。课题组长期致力于植物基因编辑技术的研究，首批在模式植物拟南芥中实现CRISPR介导的基因编辑；开发了编辑窗口多样化的植物碱基编辑工具箱，建立了脱靶效应最小化的高保真碱基编辑器；利用碱基编辑器编辑内含子剪接位点建立了植物基因失活的新策略；建立了高效的植物基因原位激活系统dCas9-TV，并利用该系统在水稻中实现对多个内源基因的同时原位激活；而且发现了基因编辑可造成植物高频的缺失/倒置双等位变异。

王凤珠，中山大学生命科学学院副研究员。2018年博士毕业于中山大学，主要聚焦植物应对非生物或生物胁迫的机制以及植物基因编辑技术的研究，获得国家自然科学基金青年项目和面上项目等多个项目的资助。近些年以第一或通讯（含共同）作者在Nat Commun, Trends Plant Sci, J Integr Plant Biol, J Exp Bot, Plant J等国际主流期刊发表多篇论文。

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