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TOBIAS：基于ATAC-Seq数据的足迹分析工具

已有 7078 次阅读 2020-10-5 02:03 |个人分类:论文交流|系统分类:论文交流| ATAC-Seq, 足迹分析, 转录因子

众所周知，MNase-Seq、DNase-Seq、FAIRE-Seq和ATAC-Seq都是测量染色质开放性的技术。它们彼此的共同点是都能够识别染色质的某些开放区域。注意：是“某些”，而不是全部。而彼此之间的不同点以及优势领域也是很明显的。可以参考图1¹。

图1：MNase-Seq、DNase-Seq、FAIRE-Seq和ATAC-Seq的技术原理。

从图中可以看出，TF与裸露染色质的结合会降低染色质区域的开放性。DNase-Seq和ATAC-Seq技术都能够识别这一信息，在它的峰中会出现一个轻微的凹槽——也就是足迹（Footprint）。但由于ATAC-Seq技术的限制，凹槽的辨识度不高，难以用来做足迹分析，也就是TF与染色质的结合研究。

目前，ATAC-Seq技术凭借其低廉的价格获得广泛推广，并已经拓展到单细胞领域。ATAC-Seq代替DNase-Seq是未来的发展趋势。今天我们选取了今年八月份发表于《自然通讯》（即：Nature Communications）的一套基于ATAC-Seq数据的足迹分析流程（Framework）——TOBIAS²。由于篇幅原因，我们今天只介绍它是如何计算出这个凹槽的位置的。至于后续分析，读者可以自行查阅论文原文。

我们先回顾下ATAC-Seq的技术原理（图2）。首先，要发挥作用的染色质区域会从缠绕的组蛋白上解开，变成裸露状态。然后，我们用Tn5转座酶去切割染色质。Tn5能够特异性地识别它在染色质上的结合位点并将其切断。当然，Tn5的特异性会导致其切割位置存在偏差，但理论上我们可以认为它在染色质上是均匀用力的。其中，裸露的位置很容易被Tn5识别；而被TF结合的位置就会受到保护，很难被切割；至于组蛋白缠绕的地方，那就受到“完美庇护”，被切割的可能性非常低。然后，切下来的片段（Fragment）会经过PCR扩增和二代测序得到大量的读段（Read）。读段指的是片段两端被测序的短序列。接下来，用基因组回帖工具（例如：Bowtie³）讲过滤后的读段比对到基因组上，然后可以通过Peak-Calling工具（例如：MACS⁴）绘制出峰图。图2最后一步中的蓝色区域就是足迹，它无法通过ATAC-Seq数据直接得到，需要经过一系列计算得到。这就是我们今天的主题。

图2：ATAC-Seq技术流程。

今天我们介绍的这个TOBIAS工具需要三种输入数据：1）ATAC-Seq的测序数据，也就是读段（注意：并没有进行Peak-Calling），2）TF的模体（Motif）剖面矩阵，和 3）基因组序列注释信息（图3）。今天我们只讨论计算足迹的流程，其实只涉及到ATAC-Seq测序数据。首先，比对到基因组上的读段反映出Tn5的切割位置。但是Tn5本身具有序列特异性，也就是说即使是同样裸露的两个区域，由于序列的不同，Tn5切割的频次也不同。我们要排除这种影响，直观的方案就是估计Tn5切割位点的偏差分布，然后用实验数据生成的读段分布减去偏差进行矫正，得到矫正后的读段覆盖度，它反映了每个位置足迹存在的可能性。这里作者采用了二核苷酸权重矩阵（Dinucleotide Weight Matrix，DWM）估计出这个偏差分布⁵。这个偏差分布是针对基因组上的单个碱基位置的。为了将其连续化，作者估计出每个100 bp长度的窗口内部偏差的平均值。这样每个位置足迹出现的可能性已经得到了。然而，足迹是基因组上的一个个窗口，而不是单独的位置。因此，我们还有最后一步——找到这个窗口。作者采用了一个简单粗暴的方法，对窗口可能出现的位置以及窗口的大小进行穷举，最终选取足迹得分最高的那一组搭配。这里的足迹得分定义为每单位长度ATAC-Seq的每一个峰上足迹外部读段覆盖度，减去足迹内部读段的覆盖度。