Urinary complement proteins and risk of end‑stage renal disease: quantitative urinary proteomics in patients with type 2 diabetes and biopsy-proven diabetic nephropathy

尿补体蛋白与终末期肾病风险：2 型糖尿病和活检证实的糖尿病肾病患者的尿定量尿蛋白质组学

期刊：Journal of Endocrinological Investigation

影响因子：4.256

第一单位：四川大学华西医院

作者：L. Zhao et al.

发表时间：2021年5月27日

研究手段：蛋白质组学

研究背景

2019年糖尿病(DM)已波及全球约4.63亿成年人。糖尿病肾病(DN)在大约21.3%的DM患者中发展，已成为全球终末期肾病(ESRD)的主要原因。糖尿病肾损害的发生和进展广泛依赖于临床参数，但参考价值有限。因此确定DN进展的新预后生物标志物和治疗靶点至关重要。尿液是肾脏产生的一种液体，可以提供有关肾脏病理生理学的信息。因此，有必要对DN患者尿补体蛋白与肾脏组织学变化之间以及补体蛋白与ESRD之间的关系进行研究。

研究结果

1.非靶向蛋白质组学

在非靶向蛋白质组学研究中，通过过滤辅助蛋白质组制备方法共鉴定了600种蛋白质，与2 型糖尿病(T2DM)组相比，伴有DN的T2DM组中242种蛋白质上调，272 种下调，层次聚类分析显示了三组之间尿蛋白表达的差异(图1a)。KEGG功能分析表明了不同尿蛋白主要与补体和凝血级联反应有关(图1b)。

图1 过滤辅助蛋白质组制备法尿液非靶向蛋白质组学结果。(a) 对HC、T2DM、T2DM和DN中上调和下调的尿蛋白的分层聚类分析；(b) KEGG的功能分析。

2.靶向蛋白质组学

靶向蛋白质组学证明年龄、性别分布、BMI、血压和基线肾小球滤过率(eGFR)在缓慢和进展性eGFR下降者之间具有可比性(表1)。此外，eGFR进展性下降者和缓慢下降者的药物使用没有显著差异。然而，与eGFR缓慢下降者相比，eGFR进展性下降者的糖尿病病程较短且基线蛋白尿较高。此外，与缓慢下降者相比，进展性下降者的RPS IIb和III类百分比较高，而I类百分比较低。eGFR进展性下降者的间质纤维化和肾小管萎缩(IFTA)评分高于eGFR下降缓慢者。

3.HC、T2DM和伴有DN的T2DM患者的尿补体蛋白分布

图2显示了HC、T2DM以及 T2DM-DN患者每单位总尿蛋白的尿补体蛋白分布。与HC和T2DM相比，T2DM-DN的尿补体C2、C3和C9丰度较高，但补体C1QA、C1S、C4A、C4B、C5、C6、C7和C8A的尿补体丰度较低。在补体调节蛋白中，补体因子H(CFAH)的尿丰度显著升高，而T2DM-DN的补体因子I(CFAI)、衰退加速因子(DAF，也称为CD55)、CD59和CDLUS)显著降低。三组间补体因子B、因子H相关蛋白1(FHR1)和FHR2的尿丰度相似。当按eGFR下降的年率进行分层时，eGFR进展性下降的T2DM-DN患者的尿补体 C2、C3和C9水平显著高于eGFR缓慢下降者。与eGFR缓慢下降者相比，eGFR进展性下降者的尿补体调节蛋白(如CFAH)显著升高，而尿DAF和CD59显著降低。在进展性或缓慢eGFR下降的患者中，C1QA、C1S、C4A、C4B、C5、C6、C7和C8A以及补体调节蛋白CFAI、CFAB、FHR1和FHR2的尿液丰度没有显著差异。

图2 HC、T2DM以及 T2DM-DN患者每单位总尿蛋白的尿补体蛋白分布

4.尿补体蛋白与糖尿病肾损伤指标的相关性

补体蛋白与糖尿病肾损伤指标的相关系数矩阵如图3所示。79%的尿补体蛋白与基线eGFR相关，尿补体蛋白C2、C3、C4A、C4B、C6、C7、C9、CFAI、CFAB、CFAH、FHR和FHR2的丰度与基线eGFR显著负相关，补体调节蛋白DAF和CD59的尿液丰度与基线eGFR呈正相关(图3a)。T2DM-DN患者的尿补体蛋白丰度与eGFR年下降之间的关系矩阵图显示C3、C9和CFAH的丰度与eGFR年下降呈负相关，而C5、DAF和CD59的丰度与eGFR年下降呈正相关(图3b)。进一步的线性回归分析(图3c)表明RPS肾小球分类与高丰度的C2、C4A、C9、CFAH、CLUS和低丰度的DAF和CD59显著相关。IFTA评分与高丰度的尿补体C2、C3、C9、CFAI、CFAB、CFAH、FHR1和FHR2相关。

5.补体蛋白与终末期肾病(ESRD)的风险相关性

利用Cox比例风险模型预测进展为ESRD的风险，通过单变量和多变量Cox比例风险分析确定了较高丰度的尿蛋白CFAH和较低丰度的尿蛋白DAF与 T2DM-DN患者进展为ESRD的较高风险显著相关（图4 a-d）。此外，较高水平的尿补体C2和C3与ESRD进展的较高风险显著相关，表明凝集素和经典补体途径一定程度的活性可能与T2DM-DN患者较低的肾脏存活率有关。

根据临床和病理参数和尿补体蛋白CFAH或DAF预测ESRD的受试者工作特征曲线如图5所示。尿液中CFAH和DAF丰度的AUC大于eGFR和蛋白尿(图5a)，此外，尿中CFAH和DAF丰度的AUC均大于任何病理参数(图5b)，包含CFAH或DAF的模型比只有临床参数(eGFR和蛋白尿)或只有病理参数(RPS分类、IFTA、间质炎症、动脉硬化和动脉透明化)的模型具有更大的AUC(图5c, d)。

图3 补体蛋白与糖尿病肾损伤指标的相关系数矩阵。(a) 尿补体蛋白与糖尿病肾损伤基线参数之间的相关系数矩阵；(b) 随访期间尿补体蛋白与eGFR年下降之间的相关系数矩阵。(c)尿补体蛋白与DN病理参数之间的相关系数矩阵。

图4 尿补体蛋白与T2DM-DN患者进展为ESRD的风险。(a) 单变量Cox比例风险模型；(b , c) 两个多变量Cox比例风险模型；( d ) 第三个多变量Cox比例风险模型包括在第二个多变量模型中与ESRD显著相关的所有蛋白质。

CFAH是一种丰富的血清糖蛋白，是替代途径最重要的循环调节剂之一。它在肝脏中组成型表达，并由内皮细胞、上皮细胞和足细胞局部表达。临床研究表明CFAH多态性与糖尿病患者的不良临床结果之间存在关联。实验研究表明，在没有CFAH的情况下，血浆中补体替代途径的自发激活会导致补体C3的消耗、继发性血浆C3缺乏以及 C3 沿肾小球基底膜的大量积累。

DAF是一种糖磷脂酰肌醇锚定蛋白，在足细胞和上皮肾小管细胞上均有表达，可C3和C5转化酶。在链脲佐菌素诱导的糖尿病肾小球硬化中，足细胞特异性DAF 缺乏会激活C3a/C3aR信号，导致肌动蛋白细胞骨架重排和足细胞损伤。链脲佐菌素诱导的糖尿病动物模型显示足细胞膜上 DAF 裂解增加，导致肾组织和尿液中DAF水平降低。结合此研究，DN中较低丰度的尿DAF与较高的ESRD风险之间的关联表明DAF对肾脏疾病进展具有重要的保护作用。

结论

研究证明T2DM-DN患者补体系统过度激活，表现为补体蛋白尿排泄异常。尿蛋白CFAH的较高丰度和DAF的较低丰度与进展为ESRD较高的风险密切相关。这些结果表明，补体途径的过度激活可能与进展为ESRD的更高风险有关。因此，治疗性靶向补体途径可以缓解DN的进展。

文章链接：https://doi.org/10.1007/s40618-021-01596-3.

参考文献：

Zhao, L., Zhang, Y., Liu, F. et al. Urinary complement proteins and risk of end-stage renal disease: quantitative urinary proteomics in patients with type 2 diabetes and biopsy-proven diabetic nephropathy[J]. J Endocrinol Invest, 2021, 44: 2709-2723.