单正链RNA病毒包括丙型肝炎病毒（HCV）、寨卡病毒（ZIKV）、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）等一大类危害人类健康的病毒。单正链RNA病毒具有保守的复制机制，均由病毒的非结构蛋白起始，在宿主膜上组装病毒的复制酶（replicase）。复制酶是重要的抗病毒靶点。目前研制成功的能治愈HCV感染的直接抗病毒药物均靶向复制酶中的病毒非结构蛋白，且其中达卡他韦（daclatasvir）类抑制剂针对没有任何酶活性的NS5A蛋白，通过抑制病毒的复制酶组装发挥抗病毒作用。深入理解病毒复制酶组装的分子机制，可为理性设计抗病毒药物提供理论基础及新的思路，尤其针对目前尚无有效抗病毒药物的其他单正链RNA病毒。

目前虽然HCV复制酶组份NS3、NS4A、NS5B以及部分NS4B和NS5A的结构已经被解析，但解析整个复制酶复合物的结构仍存在很大的挑战。复制酶复合物作为膜相关的蛋白复合物，其结构学研究一直是一个难题。复制酶复合物组份由于其膜蛋白特性或多次跨膜特性，其丰度低且难于纯化；复制酶的组装依赖于宿主因子且与病毒蛋白翻译折叠高度偶联，使得通过纯化各组份蛋白在体外进行重构几乎不可能实现。因此，尚缺乏有力的研究手段来认识在细胞内的单正链RNA病毒复制酶复合物内部的精细结构及其组装的分子机制。

生物正交反应体系利用琥珀密码子(TAG)编码具有光活性基团的非天然氨基酸（UAA），在一对特异性识别UAA和TAG的tRNA和氨酰tRNA合成酶（aaRS）的作用下，可在蛋白质翻译的过程中将有光交联活性的UAA引入至琥珀密码子位点，以实现特定氨基酸位点光介导的交联反应。由于光交联反应严格要求于相互交联的原子基团的距离在原子尺度内（小于3Å），因此在某一特定氨基酸位点的光交联图谱能提供有关蛋白与蛋白之间或蛋白在复合物内部相互作用的位点信息，进而可能转化为复合物的结构信息。结合病毒的反向遗传学，可以在体内对病毒复制酶复合物中各组份的相互作用进行精确解析，以提供复制酶复合物的结构与动态信息，并提示其组装机制。

该研究首先建立了适用于解析HCV复制酶组装的生物正交反应体系，然后在表达HCV NS3-5B的复制酶组装替代系统中，利用生物正交反应体系将具有光交联活性的UAA azF (4-Azido-L-phenylalanine) 依次引入到NS4B胞浆侧的氨基酸位点以及NS5A 的N端的两性alpha-螺旋（AH）的氨基酸位点，通过光介导的交联反应，对复制酶重要组份NS4B和NS5A所参与的相互作用图谱进行鉴定。

研究结果发现NS4B主要通过其N端的两性alpha-螺旋AH1以及其C端的alpha-螺旋H2 的L237氨基酸进行寡聚化，且L237介导的寡聚化是NS4B寡聚化的前提。根据NS4B的寡聚图谱，推测NS4B的寡聚化形式为先形成二聚体，再形成同型（头头结合）或异形（头尾结合）寡聚体。寡聚化的NS4B可能作为复制酶的组装平台。

进一步研究发现，NS4B通过其C端的alpha-螺旋H2的氨基酸位点S227、D228、A229和R232同NS3相互作用，作为NS3在NS4B 上的停靠位点（docking site）；NS5A通过其N端的两性alpha-螺旋AH与NS4B相互作用。NS4B与NS3和NS5A的结合可以调节复制酶内部的相互作用，促进了NS3-NS4B-NS5A复合体的组装，提示NS4B 的C端的alpha-螺旋H2和NS5A 的N端的两性alpha-螺旋AH是复制酶组装的核心元件。

根据晶体结构提示，纯化的NS5A通过其DI结构域形成两种不同的二聚体形式。该研究首次在复制酶组装的细胞中检测到其中一种特定的NS5A的二聚体；并且发现NS5A 的两性alpha-螺旋AH参与介导NS5A二聚化，且两性alpha-螺旋AH介导的二聚化和NS5A DІ介导的二聚化相互影响。特定二聚体的确定为理解NS5A在复制酶中的作用提供了重要线索。

最后，利用HCV亚基因组复制子证明了该研究鉴定到的复制酶组装的关键氨基酸位点在病毒复制中起着重要作用。总之，该研究鉴定到HCV复制酶组装的关键氨基酸位点，揭示了HCV复制酶组装的核心元件，解析了复制酶的精细结构并提出了复制酶组装的可能机制。鉴于复制酶为单正链RNA病毒的共有结构，本研究为探索其他单正链RNA病毒复制酶复合物的组装提供了新的方法和思路。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2021.03.006