文献来源：Clinical epigenetics 9,2

摘要

背景:本研究的目的是评估大肠癌各期肿瘤组织中SDC2甲基化的频率，并探讨用实时定量 PCR检测粪便DNA中SDC2甲基化的可行性。

方法：组织样品采用亚硫酸氢盐焦磷酸测序法测定SDC2甲基化状态。粪便样本采用LTE-qMSP分析方法进行SDC2甲基化分析。LTE-qMSP分析方法由连续两轮的PCR分析组成，包括SDC2的单向线性目标富集（LTE）和SDC2的甲基化特异性定量实时PCR（qMSP）。其检测限为0.1%甲基化（相当于从6200个基因组拷贝中检测出6个拷贝）。

技术路线：

培养细胞株、临床组织样本——SDC2甲基化测序——甲基化指数（MtI)

粪便样本——LTE-qMSP——两轮PCR扩增——Ct值

实验设计：

结果：甲基化水平检测结果显示，原发性肿瘤100%，腺瘤性息肉90.6%，增生性息肉94.1%，正常组织0%。SDC2甲基化水平随着病变的加重而显著升高（P<0.01）。LTE-qMSP粪便DNA检测SDC2甲基化，将不同分期（I～IV）的CRC患者（n = 50）和癌前病变（n = 21）与健康人（n = 22）比较，CRC和小息肉的总灵敏度分别为90.0%和33.3%，特异性为90.9%。

结论：作为一种基于粪便DNA的SDC2甲基化检测方法，LTE-qMSP可用于结直肠癌的无创性诊断工具和早期检测。

引言

本研究的目的是试图用实时荧光定量 PCR方法检测粪便DNA中SDC2甲基化状态来评估患者患结直肠癌的风险。

材料与方法

1、试剂

化学试剂引物和荧光探针。

2、细胞株

细胞株：人结肠癌细胞HCT116、SW480和HT-29。

培养基： RPMI 1640培养基，添加10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素。

培养条件：37°C、5% CO2，加湿培养箱中培养。

3、临床标本

3.1息肉组织石蜡切片（n = 49）

3.2新鲜原发性大肠肿瘤组织冰冻切片（n = 18）。

用标准切片机切割组织块以产生连续切片。它们被安装在粘有硅烷涂层的载玻片上。通过苏木精和伊红染色标记和鉴别息肉和肿瘤，然后供外科病理专家进一步开展DNA研究。

3.3正常人粘膜基因组DNA（n = 5）。

3.4粪便样本：病理学确诊的结直肠癌（n = 50）、腺瘤性息肉（n = 21）和正常健康人（n = 22）。

4、DNA提取

4.1组织和细胞系：基因组DNA用QiaAmp DNA迷你试剂盒提取。

4.2粪便样本：使用QIAamp 粪便DNA迷你试剂盒提取。

5、亚硫酸氢盐处理

5.1亚硫酸氢钠处理：在65℃下处理基因组DNA 2.5h。

5.2脱硫：在室温下脱硫20 min。

5.3过柱纯化：亚硫酸氢钠转化的DNA用Zymo-Spin IC柱纯化。

5.4洗脱：用10μL蒸馏水洗脱。洗脱后的DNA立即用于甲基化分析，或在-20°C下储存。

6、亚硫酸氢盐焦磷酸测序法测定组织中SDC2基因甲基化

6.1引物设计：利用热标记分析设计软件v.2.0对SDC2基因5′调控区149bp区域（包括4个CpG二核苷酸位点（+456，+460，+466，+473bp）进行分析，设计亚硫酸氢盐PCR特异性和热测序特异性引物：

SDC2基因甲基化扩增引物

6.2 PCR体系：20ng亚硫酸氢钠修饰的DNA，基因特异性引物，反应体积25μL，用甲基化特异性PCR试剂盒扩增。

6.3 PCR反应设置：

94°C 10分钟，然后45个周期（94°C，30秒，56°C，45秒，72°C，40秒。然后将所有反应在72°C下孵育10分钟以进行最终延伸。

6.4测序：使用PyroMark ID96仪器和PyroMark Gold Q96试剂进行测序。简言之，PCR产物经生物素处理后，固定在链霉亲和素包裹的Sepharose HP珠上进行测序。

6.5测序数据处理：每个位点的C/T比值定义为该位点的甲基化指数（MtI），得出每个CpG位点的甲基化指数，然后计算出4个CpG位点的平均甲基化指数。非CpG的甲基化胞嘧啶被用作内部对照，以检查亚硫酸氢钠转化的保真度。

6.6阳性确定：如果样品的甲基化指数（MtI）大于焦磷酸测序检测限的5%，则认为是甲基化阳性。

7、meSDC2 LTE-qMSP的性能分析:

7.1 SDC2甲基化DNA的检测限（LoD）

7.1.1 阳性标准物质: HCT116基因组DNA

7.1.2阴性标准物质:人类淋巴细胞基因组DNA(未甲基化的基因组DNA)。

7.1.3梯度稀释:甲基化百分比为1.0、0.5、0.25、0.1、0.05和0%的混合物。

7.1.4检测限: 重复24次（同一天用同一台实时PCR仪独立运行3次，重复8次）。

8、粪便DNA甲基化测定（meSDC2-LTE-qMSP法）

为了测量SDC2甲基化，在步骤1中引入LTE，以便从亚硫酸氢钠修饰的DNA中特异性地富集甲基化的SDC2靶DNA。此外，COL2A1基因缺乏CpG二核苷酸的区域被用作对照[25]，以估计可扩增模板的数量和亚硫酸氢盐转化是否充分。共20μL反应混合物，含有2.0μg亚硫酸氢钠转化的粪便DNA，每个0.05μM的SDC2甲基化特异反义和COL2A1基因特异反义引物连接到5′通用序列，以及4μL的5×AptaTaq PCR主混合物（Roche Diagnostics，Basel，Swiss）。循环条件为：95℃5min，35次95℃15s，60℃60s，LTE后反应混合物体积放大至40μL，含8μL 5×AptaTaq PCR主混合物，0.25μM SDC2甲基化特异性检测引物，0.125μM SDC2探针（FAM），0.125μM COL2A1检测引物，62.5nm COL2A1探针（Cy5），0.25μM通用序列引物。在Rotor基因Q实时PCR系统（德国希尔登桥根）上进行实时PCR。热循环条件为：95°C持续5min，然后40次95°C持续15s，60°C持续60s。加热和冷却速率分别为20°C/s和15°C/s。每次试验中，亚硫酸氢钠转化甲基化（HCT116）和非甲基化基因组DNA用作甲基化对照。也包括非模板控件。利用Rotor基因Q软件计算循环阈值（Ct）。

根据检测结果的受试者操作特性曲线（ROC）分析，选择了SDC2甲基化实时PCR检测中CT的临界值。在40岁时，确定了鉴别结直肠癌患者和健康人的最佳敏感性和特异性的最佳Ct值界限。因此，在解释LTE-qMSP法检测SDC2甲基化时，如果CT值在40个周期内，则如果SDC2甲基化的Ct值不可检测，则样本为阳性，并被视为阴性。用连续稀释的基因组DNA（HCT116）对COL2A1进行分析性能试验，检测限为10pg（约3个基因组拷贝），Ct值为36（数据未显示）。因此，只有当COL2A1的CT值≤ 36时，试验结果才被接受。

9、统计分析

所有统计分析均使用MedCalc 9.3.2.0版（MedCalc软件，比利时奥斯特德）进行。P值小于0.05被认为具有统计学意义。计算ROC、ROC下面积（AUC）和95%可信区间（CI）。用Kruskal-Wallis试验比较甲基化水平和临床病理特征。

 结果与分析

亚硫酸氢钠焦磷酸测序法检测大肠组织中SDC2基因甲基化水平MtI。在正常黏膜（N）、增生性（HP）、腺瘤性息肉（Ade）和大肠癌组织中检测SDC2基因甲基化水平。每个样品的MtI用方框图和晶须图表示。用Kruskal-Wallis试验计算，腺瘤性息肉组与正常对照组、增生性息肉组与正常对照组、CRC组与正常对照组、CRC组与腺瘤性息肉组SDC2的MtI在 < 0.01时差异有统计学意义（_{说明SDC2甲基化水平随着肿瘤发展而升高，同时，同是肠癌患者，甲基化水平变异很大}）

亚硫酸氢钠焦磷酸测序法检测大肠组织中SDC2基因甲基化水平。在正常黏膜（N）、增生性（HP）、腺瘤性息肉（Ade）和大肠癌组织中检测SDC2基因甲基化水平。每个样品的mti用方框图和晶须图表示。用Kruskal-Wallis试验计算，腺瘤性息肉组与正常对照组、增生性息肉组与正常对照组、CRC组与正常对照组、CRC组与腺瘤性息肉组SDC2的MtI在 < 0.01时差异有统计学意义

粪便DNA中SDC2甲基化状态的meSDC2-LTE-qMSP检测。采用meSDC2-LTE-qMSP法检测不同时期结直肠癌患者、腺瘤患者（Ade）和健康正常人（N）粪便DNA。SDC2甲基化的相对水平分布在每个样本的CT值中表达为40-CT。较高的40-CT代表较高的SDC2甲基化水平。如果未检测到SDC2 CT，则表示为0。SDC2基因的甲基化状态用盒形图和晶须图表示。用Kruskal-Wallis试验分别计算CRC患者与正常人、腺瘤患者与正常人SDC2甲基化水平在**P <0.01和*P <0.05时差异有统计学意义。绘制了大肠癌患者与健康正常人的b-ROC曲线。甲基化阳性和AUC的临界值在图中显示

讨论

在此之前，作者发现SDC2基因的CpG岛在正常人中是不甲基化的，而在结直肠癌患者（无论其分期如何）中它通常是高甲基化的。我们随后证明，SDC2的异常甲基化状态可以在肠癌患者的体液（如血清和粪便）DNA中检测到[20,29]，这表明SDC2有可能成为早期检测CRC的无创性分子诊断生物标记物。胃癌组织中常有SDC2高甲基化，SDC2异常甲基化与弥漫型和混合型胃癌相关[30]。SDC2高甲基化存在于HPV阳性的头颈部鳞状细胞癌和多型胶质瘤原发性肿瘤中[31,32]，但SDC2甲基化检测的临床表现在这些研究中没有涉及。

在本研究中，作者试图建立结直肠癌特异性的粪便SDC2甲基化检测方法。证实，SDC2的异常甲基化发生在几乎所有的结直肠癌组织中，无论其分期，并且在各种癌前病变的活检中也观察到，而在正常粘膜组织中没有检测到。组织标本中SDC2甲基化水平随病变程度的加重而升高。

开发基于粪便DNA的高敏感甲基化DNA检测方法用于结直肠癌的早期检测具有很多挑战性，其中包括：