2个RING型E3泛素连接酶促进SPX4的降解，调控水稻磷酸盐稳态和信号途径

名称：Two RING-Finger Ubiquitin E3 Ligases Regulate the Degradation of SPX4, An Internal Phosphate

Sensor, for Phosphate Homeostasis and Signaling in Rice

第一作者：Wenyuan Ruan

通讯作者：易可可 研究员

第一单位：中国农科院农业资源与农业区划研究所

DOI：https://doi.org/10.1016/j.molp.2019.04.003

摘要：

SPX蛋白在植物的无机磷感知，信号传导和转运具有重要的作用。水稻SPX4在Pi缺乏时大量减少，但其降解机制不清楚。该研究利用Y₂H筛选到两个和SPX4降解相关的RING型E3泛素连接酶蛋白SDEL1和SDEL2。SDEL1和2在细胞核和细胞质中均有定位，且具有E3泛素连接酶活性。在Pi充足条件下，PHR2与SDELs竞争性的和SPX4结合，抑制SPX4的泛素化降解。在Pi充足条件下，过表达SDLE1/2提高Pi积累并诱导Pi饥饿信号传导；而sdle1/2突变体降低Pi积累并较少Pi饥饿信号转导。SDEL1/2通过调节SPX4蛋白的降解，进一步调节PHR2的活性，从而实现水稻外部Pi供应时对Pi稳态和Pi信号传导的调节。

前沿：

PHRs蛋白是植物Pi信号途径的关键调控因子，可以通过结合到PSIs基因（PHTs、miRNA399/827）启动子的P1BS顺势作用元件上调节对Pi饥饿的响应。SPXs蛋白负调控PHRs蛋白，其SPX结构域可以低亲和力地结合Pi，高亲和力地结合IPs，在高Pi或低IPs状态下和多种蛋白共同调节Pi转运和Pi信号。水稻中有6个SPX蛋白，可以在Pi充足时和PHR蛋白互作抑制PHRs和PSIs地结合，抑制PHRs的转录和活性。OsSPX4可以抑制PHR2的质核转移和与P1BS基序的结合，但SPX4的降解机制尚不清楚。

结果：

1、  SDEL1和SDEL2具有E3泛素连接酶活性并可以泛素化SPX4

利用Y2H筛选到一个E3连接酶SDEL1 (Os12g35320)，水稻中具有5个同源基因，其中SDEL2(Os03g22680)同源性最高。SDEL1和SDEL2的表达模式和SPX4相似，在叶，根，茎，话要和穗中表达。水稻表达数据库和GUS报告基因系统表明SDEL1和SDEL2的转录不响应Pi饥饿，但受无Pi状态诱导。

利用Y2H，BiFC和Co-IP进一步验证表明， SDEL1和SDEL2在体内外可以和SPX4物理互作，且SDEL1、SDEL2和SPX4均定位在细胞质和细胞核。体外泛素化实验表明：在E1和E2存在时，SDEL1具有E3泛素连接酶活性（作者未纯化出SDEL2-His蛋白）。进一步研究发现，SDEL1介导SPX4的泛素化。

2、  SDEL1和SDEL2调控SPX4蛋白的稳定性

对sdel1、sdel2、OE-SDEL1、OE-SDEL2和sdel1-sdel2双突变体（Pi缺乏状态下）中GST-SPX4蛋白进行细胞外降解实验表明，sdel1和sdel2突变体中GST-SPX4蛋白的半衰期长于WT，双突变体更显著，而两个过表达株系的GST-SPX4蛋白的半衰期显著缩短，表明SDEL1和SDEL2正调控SPX4的降解。当添加MG132时，sdel1-sdel2双突变体的SPX4泛素化水平显著降低，而OE-SDEL1/2株系中的SPX4蛋白的泛素化水平显著升高，表明SDEL1/2对SPX4蛋白的泛素化至关重要。

3、  SPX4的K213和K299赖氨酸残基是SPX4的主要泛素化位点

Y2H表明SDEL1可以和SPX4的SPX结构域互作，SPX4结构域含有6个α螺旋结构，其中第5和第6个是SPX4和SDEL1互作所必须的。泛素化位点分析表明SPX4的C端的赖氨酸残基是潜在泛素化靶位点。体外泛素化实验表明SDEL1可以泛素化SPX4的K²¹³和K²⁹⁹赖氨酸残基。突变掉两个位点后进行蛋白体外降解实验发现，突变后蛋白的半衰期增长，表明K²¹³和K²⁹⁹赖氨酸残基对于SPX4降解十分关键。SDEL1通过和SPX4的SPX结构域的第5/6个α螺旋互作，泛素化K²¹³和K²⁹⁹赖氨酸残基，进而介导SPX4的降解。

4、  SPX4-RHR2复合体抑制SDEL1的泛素化作用

体外泛素化实验表明，SDEL1不能泛素化PHR2，且IPs的添加不影响SDEL1对SPX4的泛素化作用，但在IPs存在时，随着PHR2的增加，SPX4的泛素化逐渐降低，无IPs存在时，PHR2对SPX4的泛素化抑制作用显著降低。WT、phr1phr2双突变体和OE-PHR2中SPX4的细胞外降解实验表明，OE-PHR2中SPX4的半衰期显著降低，phr1phr2中SPX4的半衰期增长。LCI报告系统实验表明共转PHR2时，nLUC-SPX4/cLUC-SDEL1的荧光信号显著降低。以上表明，PHR2和SDEL1竞争性的与SPX4结合。

5、  SDEL1 和SDEL2正调控水稻Pi积累和Pi信号途径

在Pi充足条件下，OE- SDEL1/2株系的根和地上部分的Pi含量增加，干重下降，PSIs基因的表达增加；sdel1/2缺失突变体的生物量下降，PSIs基因表达降低，sdel1-sedl2双突变体更明显，表明SDEL1/2在生长发育中发挥着关键作用，且正调控水稻Pi积累和Pi信号途径。

讨论：

1、  sdel1-sdel2双突变体中的GST-SPX4稳定，但进一步孵化后还是可以降解，表明存在其他E3连接酶调控SPX4的降解；

2、  NBIP调控硝酸盐诱导的SPX4的稳定性，那么SDEL1和NBIP之间是否存在一定的联系，调控NP信号途径；

3、  水稻中6个SPX蛋白定位有差异，SPX3/4/5/6定位在细胞核和细胞质，SPX1/2定位在细胞核，且均能和PHR2互作，是否存在相似的降解模式？需要仅有研究其他SPXs蛋白的降解；

4、  SDELs-SPX4-PHRs的互作模型：在Pi充足时，SPX4和PHRs在IPs的协助下形成稳定的异源二聚体，阻止SDELs对SPX4的泛素化降解，于此同时SPX4-IPs-PHRs复合体抑制PHRs的质核转移，阻止下游基因的激活；在Pi缺乏时，IPs含量下降，导致PHRs-SPX4二聚体的解体，积累的SDELs泛素化降解SPX4，释放的PHRs进入细胞核，与PSIs基因启动子上的P1BS基序结合，启动下游基因的表达，响应Pi饥饿。