随着精准医疗时代的来临，人们对个性化医疗有了更高的需求。传统的蛋白组学针对组织或者大量细胞样本进行分析，无法体现单个细胞间的差异，这就无法实现高度个性化的精准医疗。介于此，单细胞蛋白质组学应运而生，从单个细胞维度透视生命发生发展，是目前研究和临床应用的焦点。

基于抗体的单细胞蛋白组研究，受限于抗体，只能针对有限的且选择的目标。基于质谱 (MS) 的蛋白质组学可以测量其检测范围内的所有蛋白质。肽化学多路复用技术 (如TMT标记定量) 对一小部分单个细胞进行标记，但当与主要的增强通道合并后进行质谱检测时，无疑会妨碍信号反卷积。将细胞一个接一个地进行质谱分析与信号采集，获取真正意义上的“单细胞蛋白质组学”数据，将为细胞异质性研究提供前所未有的洞察。

近日，德国马普所Matthias Mann教授团队在分子系统生物学顶刊Molecular Systems Biology (IF=11.43) 上发表了题为 Ultra‐high sensitivity mass spectrometry quantifies single‐cell proteome changes upon perturbation 的文章，报道了基于4D-LFQ技术路线的真·单细胞蛋白质组学(T-SCP)技术，结合了微型样品制备、极低流速色谱和新型捕获离子迁移率质谱仪，从而使蛋白质组学分析的灵敏度提高了10倍以上，准确且可靠的量化单个细胞中的蛋白组及其变化，并将T-SCP数据与单细胞转录组数据进行对比，表明蛋白质组是稳定的，而转录组更具随机性，为单细胞蛋白质组学的技术应用奠定了基础。

由于蛋白质不可扩增的特性，对定量技术和仪器设备的灵敏度提出了极高的需求。以单个HeLa细胞为例，其蛋白质含量低至150pg，考虑到样品制备技术过程中不可避免损失蛋白质含量，所以传统的蛋白质组学方法不足以实现真正的单细胞蛋白组学分析。

真•单细胞蛋白质组学 (T-SCP) 方法，通过对微型样品制备、极低流速色谱和新型捕获离子迁移率质谱仪三个维度的工艺优化，极大提高了蛋白质组学分析的灵敏度。4D单细胞质谱平台timsTOF SCP通过使用双离子源配置，使离子电流增加了4倍多，提升了质谱检测的灵敏度。对1、2和6个HeLa细胞中蛋白质进行鉴定，平均鉴定到了843、1279和1890个蛋白质 (下图B)。和6个HeLa细胞的结果相比，单个HeLa细胞结果的定量精度和准确度下降并不明显。

图1 基于4D蛋白组平台实现超高灵敏度蛋白组分析

由于电喷雾 (ES) 依赖于浓度，因此灵敏度随着流速的降低而增加。通过优化色谱系统及条件，极低流量色谱在25 nl/min~100 nl/min时仍可以稳定运行。结合浓缩肽纳米包装洗脱的微量样品制备工艺，优化的极低流量色谱 (100 nl/min) 比正常 1 μl/min的流速，其灵敏度提升10倍，从而实现高度可重复性的鉴定和定量。

图2 极低流速色谱和微量样品制备相结合

细胞周期是一个重要且经过充分研究的生物学过程，在单细胞研究中经常被用作测试案例。研究人员使用药物 (胸苷和诺考达唑) 处理 HeLa 细胞产生四个富含特定细胞周期阶段的细胞群 (下图A)，并使用真•单细胞蛋白质组方法进行了定量分析。研究发现，从蛋白质含量来看，G2 细胞比 G1 细胞大约 1.8 倍 (下图B)。T-SCP 正确地反映了增殖状态，同时突出了在批量样本分析中，每个细胞周期阶段内的显著异质性 (下图C)。主成分分析 (PCA) 揭示了不同细胞周期状态的蛋白质组 (下图 D)。T-SCP 数据集高定量精度地鉴定到分配给许多细胞区室、膜和生物过程的蛋白质，这些蛋白质参与了生物调节、代谢、运输和信号转导。

图3 真单细胞蛋白质组学分析细胞周期

单细胞转录组广泛应用在科研中，在单细胞水平上，转录水平与蛋白水平的关联性因不同的测量技术以及转录组和蛋白质组之间的基本生物学差异而进一步复杂化。研究人员将过滤后的 T-SCP 测量值与类似的单细胞 RNA 测序数据 (scRNA-seq) 进行了比较，发现在主成分分析中蛋白质测量与 RNA 有很大的不同 (下图B)，再次强调蛋白质组的定量产生 RNA测序的补充信息，而不是简单地重复相似的基因表达状态。此外，研究人员发现蛋白质组是稳定的，而转录组更具随机性，并将细胞间“共有的蛋白” (在430个单细胞中至少70%覆盖的前200种蛋白质)，命名为“核心蛋白质组”(下图D)。

图4 单细胞蛋白质组与转录组的比较，单细胞具有稳定的核心蛋白质组

综上所述，该研究报道优化的真•单细胞蛋白质组技术 (T-SCP)，将小型样品制备与极低流量液相色谱和新型质谱仪相结合，从而在单细胞分析的最高稳健性下产生至少一个数量级的灵敏度增益。并运用单细胞蛋白组量化了靶向扰动后的细胞异质性，从而能够在蛋白质组水平上直接分析单细胞层次结构中的药物反应。此外，单细胞转录组和蛋白质组水平的比较表明，蛋白质组是稳定的，而转录组更具随机性，突出了蛋白质层面的实质性调控，并为在单细胞水平上阐明翻译调控奠定了基础。

值得一提的是，该研究仅报道了基于HeLa细胞的研究数据，真•单细胞蛋白组技术带来的灵敏度提升可适用于任何有限样本的情况，例如少量细胞或体内材料的翻译后修饰，临床FFPE病理标本的测量等。此外，还有许多提高整体灵敏度的机会，包括更强的离子源、改进的色谱以及更好的数据分析和建模工具。这些技术的改进与突破，对于我们了解单个细胞的特征、细胞间的异质性、理解基因变化与表型变化之间的关联性等提供了有力的工具。

参考文献

1. Andreas‐David Brunner, Matthias Mann, et al. 2022. Ultra‐high sensitivity mass spectrometry quantifies single‐cell proteome changes upon perturbation. Molecular Systems Biology.

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