赖氨酸巴豆酰化修饰 (Lysine Crotonylation, Kcr) 是一种重要的蛋白翻译后修饰类型，在2011年由芝加哥大学赵英明教授团在顶级期刊Cell杂志首次报道。在结构和功能上，Kcr与之前研究的赖氨酸乙酰化完全不同，并存在于哺乳动物中与转录活性和细胞信号通路相关，已被证明在调节基因转录中起重要作用。

为探究弓形虫感染猪巨噬细胞后Kcr水平的改变，研究人员首先分别从弓形虫感染与未感染的巨噬细胞中提取总蛋白进行western blot（WB）分析。结果显示，弓形虫感染后的猪肺泡巨噬细胞中的Kcr修饰水平发生了明显变化，且弓形虫感染后组蛋白Kcr修饰水平显著降低。通过LC-MS/MS分析，共鉴定到位于458个蛋白上的1542个Kcr位点，定量到位于414个蛋白上的1286个Kcr位点。接着,研究人员进行了motif分析和二级结构预测分析，结果表明，弓形虫感染猪肺泡巨噬细胞后Kcr的二级结构不存在偏好性，并且被修饰的蛋白质氨基酸残基的表面属性也可能不受Kcr 的影响。

图1. 弓形虫感染的猪肺泡巨噬细胞Kcr修饰蛋白质组全局分析

为进一步明确弓形虫感染的猪巨噬细胞Kcr蛋白的功能，研究人员对所鉴定到的差异修饰蛋白进行GO功能注释，发现下调的Kcr蛋白主要参与染色质组织、DNA构象变化和蛋白质-DNA复合物组装等生物学过程，而大部分上调的Kcr蛋白参与了细胞氧化还原稳态、氧化还原辅酶代谢和碳水化合物分解代谢过程。以上结果表明，Kcr修饰蛋白在弓形虫感染的巨噬细胞的多种生物学过程中都发挥着重要作用。此外，蛋白质-蛋白质相互作用分析显示，大多数与核糖体和剪接体相关蛋白的Kcr水平呈下调，其中位于Histone H2A、Histone H2B、Histone H4上的17个位点的Kcr表达下调，这表明弓形虫感染对猪肺泡巨噬细胞中的组蛋白Kcr具有负调控作用。

图2. 弓形虫感染的猪肺泡巨噬细胞Kcr修饰蛋白功能分析

图3. 弓形虫感染抑制猪肺泡巨噬细胞H2BK12cr表达

HDAC是涉及许多人类疾病的主要表观遗传调节剂。因此，研究人员检测了I类组蛋白脱乙酰酶HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8的表达水平，结果显示，只有HDAC2 表达显著增加。通过进一步使用pan-Kcr抗体的WB分析证实，由弓形虫感染引起的Kcr修饰水平的降低确实是通过HDAC2介导的，HDAC2可能在弓形虫感染的猪肺泡巨噬细胞的组蛋白去巴豆酰化中起主要作用。

基于H2BK12cr在NF-κBIZ的外显子区域显著上调，研究人员检测了弓形虫感染后细胞中NF-κB通路的活性。结果表明，由HDAC2调节的组蛋白Kcr抑制了转录因子NF-κB的激活。进一步分析表明弓形虫感染增强了细胞增殖，而HDAC2表达的沉默起中和作用。研究还证明了弓形虫感染引起的巨噬细胞增殖确实是通过PI3K/Akt信号通路的激活介导的。

图4.HDAC2调节组蛋白Kcr对NF-κB活性的影响

通过分析弓形虫感染的猪肺泡巨噬细胞的全蛋白巴豆酰化修饰组学，本研究首次报道了猪肺泡巨噬细胞中巴豆酰化修饰的存在，通过全蛋白巴豆酰化修饰组学分析，为我们提供了对弓形虫感染后猪肺泡巨噬细胞中蛋白质巴豆酰化修饰的生物学过程的全面了解。同时，组蛋白巴豆酰化功能的揭示为宿主对弓形虫的免疫反应机制研究提供一定的研究依据，也为寄生虫免疫逃避机制提供新的见解。

参考文献：

Yang J, et al., 2021. Toxoplasma gondii infection inhibits histone crotonylation to regulate immune response of porcine alveolar macrophages. Frontiers in Immunology.