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参赛者：焦佳琪 （广东省微生物研究所）

参赛作品：EGFR-ROCK联合抑制细胞保护性自噬，有望攻克三阴性乳腺癌

文献标题： Combined EGFR and ROCK inhibition in TNBC leads to cell death via impaired autophagic flux

发表期刊：MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS

发表时间：2019.11

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵略性乳腺癌，其对既定的激素治疗和/或HER2靶向治疗不敏感，而传统的外科手术和全身疗法的治疗手段存在常见的耐药性复发。表皮生长因子受体（EGFR）是TNBC的潜在治疗靶标。近期研究显示，当RAF-MEK-ERK级联抑制剂与自噬抑制联合作用时具有很好的协同抗肿瘤活性。

巨噬细胞自噬（简称自噬）是一种高度动态的自吞噬生物过程。癌症情况下，自噬的激活具有两面性，它能够通过清除受损细胞器、维持细胞稳态和保护正常细胞生长而起到抑癌作用，但也可能成为多种压力下肿瘤细胞的关键生存机制。越来越多的证据表明，自噬激活对癌细胞具有保护作用，使治疗效果差/产生耐药性。因此，抑制细胞保护性自噬可以攻克此难题并促进肿瘤消退。

近期，荷兰乌得勒支大学、药物科学研究所联合荷兰蛋白质组学中心的研究人员在 蛋白质组学领域Top期刊Mol Cell Proteomics上发表了题为“Combined EGFR and ROCK inhibition in TNBC leads to cell death via impaired autophagic flux”的文章。作者之前报道过EGFR和ROCK的联合抑制作用可诱导TNBC细胞的细胞周期停滞，但其潜在机制尚不清楚。本文中研究人员运用二维蛋白质组学策略（线下高pH反相分离与nanoLC-MS/MS结合）揭示了自噬是细胞在联合抑制下的主要分子机制，单独抑制EGFR可对TNBC细胞起保护作用，而EGFR和ROCK联合抑制会导致自噬阻滞和自噬泡的积累，联合治疗对自噬的抑制作用是因为ROCK抑制后主要的细胞骨架的变化。

1. EGFR+ROCK联合抑制下抑制作用相加

作者用DMSO（对照）、吉非替尼 （EGFRi） 、GSK269962A （ROCKi） 及联合抑制剂 （EGFRi+ROCKi） 处理三阴性乳腺癌细胞 （Hs578T）（样品策略） ，发现与单独使用EGFRi和ROCKi相比，EGFRi+ROCKi联合作用可显著抑制TNBC细胞的生长。

Figure 1. 实验研究路线和蛋白质组数据总览

2. 蛋白组学分析表明，联合抑制诱导了细胞自噬

为了揭示联合作用的分子机制，研究者对不同处理条件下的TNBC细胞进行Label-Free蛋白质组学、磷酸化修饰组学定量分析（质谱策略）。数据表明，涉及到自噬过程的蛋白质簇在单EGFR抑制作用和ECFR+ROCK双重抑制作用下均显著上调，表明该处理条件可能激活了TNBC细胞的自噬。作者之后专注于自噬相关蛋白的差异调控，证实了 EGFRi+ROCKi组合处理使自噬相关蛋白积累， 显示出调节作用的增强及部分组合作用，表明 自噬过程是细胞 在 联合 抑制作用下的 潜在途径， 并 最终导致细胞死亡。 WB分析证实了EGFRi、EGFRi+ROCKi联合处理可诱导自噬，但单独ROCKi处理对自噬没有任何影响。

Figure 2. 自噬相关蛋白的差异调控分析

3. EGFRi+ROCKi联合抑制下自噬通量的受损与ROCK活性被抑制有关

接下来，作者进一步探究了自噬诱导导致细胞死亡的机制，用Cyto-ID自噬绿色染料对分别用DMSO、EGFRi、ROCKi和EGFRi+ROCKi处理的Hs578T活细胞进行染色并监测自噬活性。结果表明，EGFRi+ROCKi处理下自噬泡的增加很可能是由于自噬体清除能力受损所致。加之作者又通过CLQ诱导实验证实了细胞死亡是EGFRi诱导自噬抑制导致的，所以ROCK活性是影响有效自噬过程的关键因素

Figure 3. 不同处理下蛋白质的差异表达及细胞中的自噬通量

4. ROCKi相关的细胞骨架变化影响自噬

研究发现ROCK抑制剂对几种细胞骨架蛋白和粘着斑蛋白的表达水平有实质性影响，为进一步探究自噬调节的变化，及其与ROCKi诱导的细胞骨架变化的潜在联系，作者将分析重点放在了自噬相关蛋白上，其磷酸化状态在不同处理之间显著改变（ANOVA，FDR<0.05）。有趣的是，作者发现仅通过ROCKi处理，肌球蛋白MYO1C（S864）、SNARE蛋白STX12（S139、S142）和与肌动蛋白结合的SYNPO2（S930，S902，S226，S777）会被磷酸化，其在EGFRi+ROCKi联合抑制处理下更为显著。其中，功能性MYO1C的丧失会导致自噬结构的积累，表明自噬体-溶酶体融合步骤的选择性阻滞，使自噬物降解存在缺陷；SNARE蛋白通过介导膜融合事件在自噬过程中发挥重要作用；SYNPO2多个位点的磷酸化状态急剧下调会影响自噬体的形成。这些数据表明，磷酸化在调节自噬相关蛋白中起关键作用。ROCKi相关的肌动蛋白和微管细胞骨架的主要变化可能导致自噬通路的各个步骤受阻，从吞噬细胞形成和扩增的早期阶段到囊泡运输和与溶酶体的融合。

Figure 4. ROCK活性抑制后差异表达的细胞骨架相关蛋白

值得一提的是，ROCKi抑制自噬后，作者观察到蛋白酶体核心和亚基蛋白的显著上调，暗示自噬和泛素-蛋白酶体系统之间存在潜在的连接和串扰，对一个系统的抑制会导致另一系统的补偿性上调，但仍需要进行补充实验来证实。

Figure 5. 蛋白酶体亚基的调节和对EGFR和/或ROCK抑制的自噬

综上所述，蛋白质组学和功能数据表明，在吉非替尼治疗后，自噬被诱导，且诱导的自噬需要ROCK活性，而ROCK活性的抑制会导致自噬阻滞和自噬泡的积累，这是由于自噬体清除能力受损所致的。使用EGFR抑制剂在三阴性乳腺癌细胞中激活自噬后，可通过ROCK活性的共同抑制作用使自噬受损，导致TNBC细胞死亡。