随着以4D技术为代表的质谱方法的不断进步，蛋白质组学也逐渐从基础研究进入到了临床分析的领域。由于蛋白质是功能的执行者和药物的直接靶点，因此蛋白质组学在临床方面的应用进展一直备受瞩目。

目前的临床蛋白质组学研究，多数仍然是以新鲜或冰冻组织为样本进行的。这些样品往往缺乏足够长的随访信息，导致了其实际的研究意义受限。另一方面，福尔马林固定石蜡包埋(Formalin Fixed Paraffin Embedded, FFPE)是临床一直以来最常用的样品保存方法，这类样品不但数量多、而且时间长、随访信息完整，如果能够将这些样品应用于蛋白质组学分析，无疑会具有更好的临床价值。

马克斯普朗克生物化学研究所所长Matthias Mann是蛋白质组学研究领域的一位著名科学家，他在蛋白质组学质谱技术研究方面获得了许多重要的突出成果，改进或者发展了各种新型的技术，曾在Nature Methods，Cell等杂志上发表了一系列这一领域的研究成果。

近日，Matthias Mann 团队在预印本BioRxiv上发表题为A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large scale FFPE tissue analysis Fabian Coscia的研究论文。介绍了一种基于质谱的蛋白质组学工作流程，可直接从病理玻璃载玻片上对大型FFPE组织群组进行定量分析。作者的研究结果同时也突显了FFPE组织使用无偏蛋白质组学进行患者表型分析的巨大前景，并证明了以强大，及时且简化的方式分析大型组织队列的可行性。

文章中研究者证明了该工作流程：

1、对临床病理标本和可变样本量的广泛适用性：样本量甚至包括通过激光捕获显微切割术分离的不到10000个癌细胞。

2、高通量的检测效率：可以在100分钟的单次运行分析中始终对蛋白质组的大部分进行定量；在一个包含100多个样本的腺瘤队列中，整个检查花费了不到一天的时间。

3、高定量重复性，广泛适用于各种肿瘤类型；

4、分析结果与样本保存时间无关：作者观察到长期保存的样品（> 15年）中蛋白质鉴定降低的趋势趋于温和，但聚类为不同的蛋白质组学亚型与归档时间无关。

文献精读

1、96孔格式对FFPE样品进行蛋白质组学样品制备

FFPE本身固有的共价交联、低蛋白溶解率以及低肽段回收率，是其在蛋白质组学分析中面临的挑战。为了对大型和多样化的FFPE组织群能够开展应用，作者优化了样品制备工作流程，将激光显微切割的FFPE样品，以96孔格式进行高度平行的“单管”样品制备（图1a）。研究者分别使用有机溶剂、和基于SDS的工作流程处理了收集到的高度浆液性卵巢癌（OvCa）标本组织，并对其进行了深入的蛋白质组学分析（Q Exactive HF-X，0.5 μg每种肽样品，100分钟单次运行，DDA模式）。

图1、基于质谱的FFPE组织分析工作流程

（1）蛋白溶解率以及肽段回收率

研究发现，使用基于TFE的方案可将肽产量提高2.3倍，这表明蛋白质和肽的回收率均有提高。在5041个已鉴定的蛋白质组中，两种方法均发现92％重合，这表明尽管煮沸后组织溶解明显不同，但蛋白质提取却具有高度可比性。蛋白质标注表明同一样品的两种制剂处理的蛋白质的细胞区域分布比例几乎相同。两种方法处理的染色质和DNA结合蛋白的相对蛋白丰度没有显著差异，分析结果与FrFr（fresh frozen）OvCa组织相比也没有显著差异（图2）。这些数据表明使用基于有机溶剂的工作流程（包括染色质结合的蛋白质）可以有效地提取蛋白质。

图2、概述基于质谱的FFPE组织分析工作流程

（2）解交联效果

FFPE组织的甲醛交联主要通过碱性氨基酸残基之间的稳定亚甲基桥来保持组织结构，因此需要有效的去除交联，以逆转可能使肽鉴定变得模糊的不需要的可变化学修饰。研究者使用了“开放式修饰搜索”算法pFind，评估两种方法之间福尔马林交联逆转的差异。结果表明基于SDS和TFE的样品裂解之间没有明显差异，总体上几乎完全解交联（约95％）。

综上，这些结果表明，作者的样品处理方案可通过无洗涤剂的“单管”工作流程对FFPE组织进行可靠的蛋白质组分析。

2、FFPE蛋白质组学可广泛适用于各种肿瘤类型

研究者进一步将该工作流程应用于来自不同组织类型（OvCa、神经胶质瘤、结直肠腺瘤和尿道癌）的FFPE切片。质谱分析显示，对于宏观解剖（FFPE切片的刀片刮擦区域）和微观解剖（对玻璃膜载片进行组织的激光捕获显微解剖）样品，其具有相当的总离子流（TIC），具有出色的色谱重现性，而与癌症的起源或采集类型无关（图3A）。

图3、不同肿瘤类型FFPE组织工作流程的评估

为了评估定量重现性，比较了从两名晚期高级别浆液性患者获得的五个LCM FFPE组织的蛋白质组。同一患者的三个生物学重复的皮尔逊相关系数很高，而在患者之间则较低，表明HGSOC肿瘤蛋白质组是由患者特异性的蛋白质特征驱动的，而与解剖部位无关。胶质瘤、结直肠腺瘤、OvCa和尿道癌的主成分分析（PCA），能根据它们在第一和第二成分中的来源组织清楚地将它们分组（图3B）。

研究结果表明，该工作流程为96孔格式FFPE组织样品的蛋白质组分析提供了一个可靠的框架，适用于各种组织类型、样品输入量和基于MS的蛋白质组学策略。

3、FFPE组织工作流程显示出高定量重现性

癌症病变在多个水平上具有高度的细胞异质性，研究者关注了结直肠腺瘤的宏观解剖组织，收集了在不同日期处理的19种不同组织样本，以便准确估算整个工作流程的可重复性（图4A，左图）和切片内蛋白质组变异性（同一切片的三个不同区域，图4A，右图）。研究总共定量了6110个蛋白质组，每个样品平均5274个。总体数据完整性为86％（图4B）。对于所有分析的腺瘤，切片间变异性略低于切片内变异性（平均CV分别为18.9和20.1）（图4A-D）。

图4、评价FFPE组织工作流程的可重复性

临床上用于患者诊断和分层的已知腺瘤或结直肠癌标志物，例如E-钙黏着蛋白（CDH1），其CV低于或接近20％。值得注意的是，尽管EGFR的含量比COX-2（MT-CO2）低约100倍，但其变异程度却较低，这表明即使对于含量较低的蛋白质，其蛋白质定量分析也很可靠（图4D）。同一患者的腺瘤（N = 9）和不同患者的腺瘤（N = 9）的CV值显示出较高的蛋白质组变异，包括已知的病理学标记，表明生物学或病理学存在根本差异（图4E-F）。

这些数据一起证明了在相同腺瘤的组织切片内部和之间的良好工作流程可重复性和高蛋白质组一致性。

4、简化的FFPE工作流程适用于118种不同存档时间腺瘤

作者接下来研究了它是否可以在一天之内以最少的时间简化大型组织队列的处理。作为概念验证，作者使用单次100分钟DIA MS方法，分析了从101例患者中收集的另外118组FFPE腺瘤组织。总共量化了6254个蛋白质组，每个腺瘤样本中位数为5147个蛋白质组。对于5,230个定量蛋白质组，数据完整性为92％，对于所有6254个蛋白质组，数据完整性为81％（图5A）。

为避免潜在的抽样偏差，作者进一步研究了整个腺瘤的分子差异以及存档时间对蛋白质组的影响。作者应用了共识聚类方法，基于通过中位数绝对偏差测量的整个腺瘤中1000个最易表达的蛋白质组。结果生成了四个大小相似的主要蛋白质组，它们显示出独特的蛋白质表达谱，四个簇之间有一些重叠，这表明腺瘤组织具有共同的生物学特征（图5B、C）。

图5、118例不同归档时间腺瘤组织的流线型蛋白质组分析

接着，研究了存储时间对蛋白质组学分析的影响。根据存档时间将样本分为长期组（14-20年，N = 14），中期组（10-13年，N = 41）和短期组（6-9年N = 43）。比较不同组中定量肽的总数，发现短期组的定量肽的数量要比中期组和长期组更高（图6D）。长期存储样品中肽修饰率更高，表明随着时间的推移蛋白质会逐渐进行修饰。不同组之间的高蛋白质组相关性判断，存储时间对整体蛋白质定量的影响也很小（图6F），表明蛋白质定量通常是即使经过30年的保存也不会受到干扰。

图6、存储时间对整体蛋白质定量的影响

综上所述，借助新的工作流程，Matthias Mann团队展示了临床FFPE队列蛋白质组分析工作流程的实用性。基于96孔格式的单管工作流程，并使用MS兼容的蛋白质提取缓冲液，作者证明了与基于去污剂的样品制备具有高度的蛋白质组相似性，每个蛋白质样品的蛋白质组深度达到5000 – 6500个蛋白质组。由于组织数量在组织病理学中经常变化很大，因此该工作流程适用于少量样品也是至关重要的。为此，作者表明可以以可重复的方式分析包含少于10000个细胞的激光显微切割样品。

此外，根据病理实践的要求，可以使用该工作流程可重复处理不同实体的FFPE肿瘤类型。作者检索了OvCa、神经胶质瘤和尿道癌之间的已知生物学差异，从而验证了工作流程的整体质量。在高pH反相分离后，文中的实验结果还涵盖了大部分已知的“可作用”蛋白，这表明FFPE组织的蛋白质组学分析在未来将具有临床意义。

参考文献

Fabian Coscia, et al., 2019, A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large scale FFPE tissue analysis. bioRxio. doi: http://dx.doi.org/10.1101/779009.

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