编者按：今天给大家推荐的文章，来自于近日发表的Nature Communications上。研究通过丙二酰化修饰组学研究，首次关注了巨噬细胞-炎症反应-代谢-丙二酰化修饰之间的密切关系。这篇文章是蛋白质如何通过自身的翻译后修饰影响蛋白构象及蛋白与其他分子互作来发挥调节功能的一个典型案例，特地解读，分享给大家学习参考。

研究背景

丙二酰化是于2011年被首次发现的发生在赖氨酸上的一种进化保守的蛋白质翻译后修饰（PTM）类型。它的发生依赖于丙二酰辅酶A将丙二酰基团添加到赖氨酸并将其电荷从+1更改为−1。这一变化有可能破坏赖氨酸与其他氨基酸的静电相互作用并改变蛋白质构象，甚至可能影响其与靶蛋白的结合。丙二酰化已经被证实存在于多种代谢途径中，比如脂肪酸合成和氧化，线粒体呼吸和糖酵解等等。然而，更深入的丙二酰化修饰相关生理功能还鲜有报道。

代谢重组对免疫细胞功能发挥着决定性作用。其中，巨噬细胞作为具有先天免疫、炎症反应和组织修复功能的前线作战细胞，在发挥不同功能时表现出不同的代谢特征。例如那些被脂多糖（LPS）激活的促炎巨噬细胞，表现出高度糖酵解依赖。而另一种三羧酸循环中间介导物柠檬酸盐的积累，能促进炎症介质的产生，比如硝酸氧化物和前列腺素等。丙二酰化底物和柠檬酸盐的下游代谢物丙二酰辅酶A，在免疫细胞和炎症中所发挥的作用尚未被探索。

近日，来自都柏林圣三一学院和GSK的研究人员共同在国际专业学术期刊Nature Communications上发表论文，首次关注了巨噬细胞-炎症反应-代谢-丙二酰化修饰之间的密切关系。研究人员通过对小鼠骨髓来源的巨噬细胞进行脂多糖（LPS）处理并进行丙二酰化修饰组学分析（修饰组学定量由景杰生物完成），共鉴定到412个蛋白上的843个发生了丙二酰化修饰的位点。尤其值得注意的是，作者鉴定到GAPDH上的赖氨酸213位点发生丙二酰化修饰。正常情况下，GAPDH结合并抑制几种炎症相关mRNA的翻译，包括编码TNFα的。一旦GAPDH发生丙二酰化修饰，其与编码TNFα的mRNA分离，促进翻译。因此这项研究首次识别到丙二酰化可作为调节GAPDH与mRNA之间的结合来促进炎症的关键信号。

研究速读

1、丙二酰辅酶A可改变巨噬细胞中细胞因子的产生

作者首先用LPS对骨髓来源的巨噬细胞进行处理，发现丙二酰辅酶A的含量在处理24小时后显著上升（图1a）。与此同时，丙二酰辅酶A合成酶ACC1和ACSF3的表达量也显著上调 （图1b）。利用siRNAs对俩个合成酶进行敲低之后，多个促炎症细胞因子的表达量收受到明显抑制，而一些抗炎症细胞因子则表达量急剧上升。值得注意的是，TNFα的表达只受到ACC1敲低影响，并且仅限于蛋白层面（图1c）。它的转录水平不受丙二酰辅酶A干扰（图1d）。反过来，当用丙二酰辅酶A处理ACC1敲低的巨噬细胞时，TNFα的表达量可恢复到正常水平（图1e）。结果表明：LPS激活的巨噬细胞可产生丙二酰辅酶A来改变细胞炎症因子的合成。

 图1. LPS激活的巨噬细胞可产生丙二酰辅酶A来改变细胞炎症因子的合成

2、巨噬细胞的激活导致了蛋白丙二酰化修饰显著上调

由于丙二酰辅酶A的含量在LPS处理后显著上升，作者继而推测巨噬细胞的激活可能引起蛋白的丙二酰化修饰并初步利用western证实（图2a）。研究人员对脂多糖（LPS）处理前后的小鼠骨髓来源的巨噬细胞进行蛋白提取（样本策略），并利用label-free的方法进行丙二酰化修饰组学定量分析（质谱策略），作者共检测到发生在412个蛋白上的843个丙二酰化修饰位点。280个位点在LPS处理后修饰水平上调，其中78个位点仅在处理后发生翻译后修饰。这些发生修饰的蛋白参与到了包括RNA调节，信号传导，免疫反应等多种功能当中（图2b）。

图2.巨噬细胞激活后丙二酰化修饰水平上升

3、LPS引起GAPDH第213号赖氨酸位点丙二酰化修饰

通过修饰组学，作者鉴定到甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）同样发生了丙二酰化修饰。GAPDH不仅在糖酵解中发挥重要作用，还可以直接与RNA结合并调节翻译过程。因此，作者选择对GAPDH进行具体观测来更深入的了解丙二酰化与炎症反应的关系。首先，用丙二酰化抗体进行western实验，证明GAPDH确实随着LPS处理发生丙二酰化修饰（图3a）。当直接用丙二酰辅酶A处理纯化后的GAPDH时，丙二酰化修饰同样发生。除此之外，作者鉴定到主要是GAPDH上K213发生修饰，K213位点不仅在其催化区域内，还处于其RNA结合域（图3b）。

图3. LPS引起GAPDH上K213位点丙二酰化修饰

4、GAPDH通过与RNA结合调节TNFα产量

已有研究证明，促炎巨噬细胞内糖酵解过程增强。作者首先对GAPDH的活性进行了观测，发现随着LPS处理，其活力不断提高（图4a）。在利用GAPDH酶活抑制剂HA和糖酵解抑制剂2-DG分别分别对激活的巨噬细胞进行处理后，HA可显著抑制TNFα蛋白表达量但不影响其mRNA水平（图4b&c）。作者继而推测GAPDH通过其与RNA直接结合的能力来调控转录后的TNFα表达。先用GAPDH抗体进行IP，再利用qPCR检测其结合的RNAs，作者发现在休眠巨噬细胞中GAPDH与TNFα的RNA相结合。但俩者间结合随着LPS对巨噬细胞的激活逐渐消失（图4d）。

 图4. GAPDH通过与RNA结合调节TNFα产量

除此之外，作者发现GAPDH本身的表达量并不受LPS处理影响（图4e），这意味着LPS可能通过蛋白翻译后修饰来转变GAPDH活性。为证实这一点，先用HA处理细胞再进LPS激活，GAPDH与TNFα的mRNA结合能力明显增强（图4f）。

小结

本研究基于丙二酰化修饰组学，首次展示了巨噬细胞如何通过体内蛋白的丙二酰化修饰来调节炎症相关因子的表达。

GAPDH作为已知的糖酵解代谢调节酶，在休眠的巨噬细胞内，结合并抑制TNFα的mRNAs的翻译。在LPS刺激下，GAPDH的K213位点发生丙二酰化修饰，导致其与TNFα的mRNA分离，促进其翻译。这篇文章是蛋白质如何通过自身的翻译后修饰影响蛋白构象及蛋白与其他分子互作来发挥调节功能的一个完美案例。

参考文献：

Silvia Galván-Peña, et al., 2019, Malonylation of GAPDH is an inflammatory signal in macrophages,Nature Communications.