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选哪个lncRNA的哪段设计引物？RT-qPCR验证，我要百发百中！
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本文转载自嘉因微信公众号，已获得授权。查看最新文章，敬请关注嘉因，微信ID：rainbow-genome
作者：小丫 来源：嘉因
前几年是lncRNA测序时代，最近进入了后lncRNA时代，人们都在研究lncRNA的功能和调控机制。
去年4月，小丫写了这篇帖子，得到的评价是“看透了lncRNA验证，但描述得不够清楚”。最近又遇到有人问这个问题，就把这帖子拿出来，重新编辑，力求逻辑更顺畅，把脑中所想传达给更多的人。
问题的提出
lncRNA-seq获得了大量差异表达lncRNA，要做RT-qPCR验证。
选哪个lncRNA？选变化倍数大的？表达量高的？
选lncRNA的哪段设计引物？跟其它基因有重叠怎么办？
总体原则
1. 用跟测序同一批次的RNA样品做RT-qPCR；
2. 按lncRNA类型排序，优先选择lincRNA（基因间的lncRNA），和位于其他基因intron区的lncRNA；与其他基因exon有重叠的lncRNA，可选择其中无重叠的区段；
3. 按表达丰度TPM排序，优先选择前50%的lncRNA；按变化倍数排序，优先选择前50%的lncRNA；
注：具体限制多少TPM或变化倍数，由整体测序深度和差异表达基因的数量决定，保留排在前面的一半左右，自己斟酌；
4. 一定在测序结果里看到明显变化的峰的位置设计RT-qPCR引物；
为什么遵循以上原则？下面逐个解析。
解决方案
一、Sample准备
RT-qPCR验证sequencing结果，是用一个技术平台验证另一个技术平台的结果，所以，除了所使用的技术平台不同以外，其他条件都要尽量相同，其中最重要的就是样品一定要相同。
测序和RT-qPCR，要求来自同一管RNA。如果要做RT-qPCR时需要再次提取RNA，那么退而求其次，要来自跟测序样品同一批次的细胞或同一块组织。
具体可以这样操作，分两种情况：
如果送RNA到测序公司。自己提取RNA，一半RNA送公司测序，保留另一半RNA，冻存于-80，最好存液氮，或者反转录后存cDNA。
如果送细胞或组织到测序公司。由测序公司提取RNA，要求测序公司将剩余的RNA返还。
测序分析结果回来了，用跟测序同一批次的RNA样品做RT-qPCR。
如果用来做RT-qPCR的样品跟测序不是同一批次，那么你验证的就是两层面的叠加：技术平台间的差异 + 生物学重复间的差异。如果结果不一致，就搞不清楚是技术造成的差异，还是生物学重复的不一致。
二、不能选哪种lncRNA
先说什么样的lncRNA不能选来做qPCR验证。
用链特异性Strand-specific技术建库的lncRNA-seq，能够区分来自正义链和反义链的转录本，而普通的RT-qPCR无法区分来自不同链的RNA。
因此，不能选与其他基因exon重叠的lncRNA，否则，RT-qPCR结果就混合了两个基因的表达量。
最好选择基因间的lncRNA，即lincRNA，跟其他基因没有重叠。
其次选择位于其他基因intron区域的lncRNA。
再次，如果lncRNA的一部分与其他基因的exon重叠，另一部分不重叠，就选不重叠的那部分。
三、选哪个lncRNA
表达量高的优于表达量低的，更容易做RT-qPCR，Ct值更低，结果更可靠；另外，表达量高的基因，其差异表达筛选时的准确性更高。
表达量用丰度TPM来衡量，点击链接查看详情：
由于测序和RT-qPCR原理不同，所以sequencing和RT-qPCR计算出来的变化倍数不可比，只要变化趋势相同就算结果一致。
四、选哪段
到IGV里查看wig文件，哪个区段峰高，并且在组间变化明显，就选哪段设计PCR引物。
lncRNA某些区域可能看不到read，这可能是以下原因导致的：1. 基因有不同isoform，在你的样品里可能只表达其中一种isoform；2. PCR或测序偏好；3. 基因结构注释有问题。
RNA-seq计算lncRNA表达量和筛选差异基因时，用的是lncRNA全长read counts的总和，不代表每个区段都有表达或表达差异。因此，选择高峰所在的区段做qPCR，能保证万无一失。
举例子
在IGV里面打开wig文件，在IGV里逐个搜索满足上述原则的lncRNA，查看read分布。
栗子一
下图这个lncRNA位于基因间区，有不同的isoform，其中一些exon的read counts较多，如图中三个较高的蓝色峰，且在两个样品间有明显的变化，这三个峰所在的位置就适合设计引物。
怎样拿到序列呢？
点击IGV里的这个小图标
，然后在你感兴趣的区段左边点一下鼠标，右边点一下鼠标，就出现红色的那一段了，在红色区域点右键，copy sequence，粘贴到你的引物设计软件里，就OK啦！
栗子二
对于链特异性建库的lncRNA-seq数据，每个sample有Forward和Reverse两个track，分别代表正义链和反义链，你能看到两条链上转录出来的不同的转录本。
下图这个lncRNA位于一个蛋白编码基因的antisense（箭头标明转录方向），虽然gene结构注释认为lncRNA位于内含子区域，但其下游仍有较多的read分布，可能是基因结构注释的问题。
我标出红色的区域跟另一个基因的exon没有重叠。
这里的四个track，分别是第一个sample的Forward和Reverse，和第二个sample的Forward和Reverse。两个sample的Reverse间有明显的差异，可用来设计引物。
最后，用哪个软件设计引物？
推荐primer3，http://primer3.ut.ee，简单高效。
Product Size Ranges限制为80-150，其余全部默认。我的经验是它设计出来的第一对引物就好用。
下面的帖子可能对你有帮助：
https://wap.sciencenet.cn/blog-3372875-1090311.html
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