导读：

高通量数据聚类成OTU(s)与不聚类（直接分析数据）两种方式孰优孰劣一直存在争议。本文在近期阅读的基础上，总结了针对该问题的若干新进展（主要在微生物生态学领域），并延伸讨论这些进展对生态学其他领域（如入侵生态学等）研究可能的影响。

Thompson等人于2017年11月在Nature发表了关于地球微生物组计划的荟萃分析文章。这项浩大的工程文章调用了97个研究、27751份样品，测序得到22亿条序列，平均每个样品8万条序列。后续分析时，研究人员首先使用了传统的OTUs聚类，结果发现1/3左右的序列无法匹配已有的rRNA数据库，即这些数据将被删除或者被定义为未知序列。据此，他们最后选择了无需参考序列（不聚类OTU）的分析方法，Deblur。使用Deblur直接删除错误/误差序列，从而获得单核苷酸精度的亚OTUs（sOTUs）。这种序列分析方法使得同时处理大规模样品成为可能。文章认为，不使用97%相似度聚类、直接使用序列分析得到的结果分辨率更高。该文章的中文翻译参见“微生态笔记”。

Deblur即是上述同组研究人员推出的不聚类OTUs进行高通量数据分析的方法（Amir 2017）。算法简介如下，详细算法参见（Amir 2017）：

1）对sequence进行reads个数统计，按照丰度由大到小进行排序；

2）按照丰度高低反复对sequence进行计算，被判定为误差数据的reads将会被从所有相邻reads中减去；

3）当某个sequence的reads频次降到0时，该sequence即被删除。

Amir等人还比较了Deblur与DADA2，UNOISE2等降噪算法的效果异同。结果表明，与其他算法类似，Deblur可以提供稳定的sOTUs以获得单核苷酸分辨率的结果。Deblur的运算速率比UNOISE2低一个数量级，但是比DADA2高一个数量级。此外，Deblur的分析过程可以基于单个样品来做（不用把数据混在一起），因此可以支持大批量、不同研究的数据进行比较和分析。

DADA（Divisive Amplicon Denoising Algorithm）是Callahan等人于2012年提出的一种降噪处理方法，DADA2是2015年推出的更新版。DADA是一种分裂式分割算法。首先将每个reads全部看作单独的单元。Sequence相同的reads被纳入一个sequence，reads个数即成为该sequence的丰度（abundance），并计算每个sequence丰度的p-value。当最小的p-value低于设定的阈值时，将产生一个新的partition。每一个sequence将会被归入最可能生成该sequence的partition。依次类推，完成分割归并。研究人员使用DADA2对阴道样品进行分析，发现了OTU聚类方法未能检测到的Lactobacillus crispatus菌株。研究人员还使用三组数据集比较了DADA2与UPARSE聚类的效果差异（如下图）。结果表明DADA2可以检测到UPARSE所检测的及其不能检测的序列，说明DADA2提高了分析的分辨率和准确度。

UPARSE是Edgar推出的比较严格的聚类OTU的方法，但是Edgar本人近期也认为97%的聚类方式有些武断，认为应该将相似性阈值提高到99%或者100%。加之对DADA2的文章做出回应，Edgar推出了UNOISE2的降噪处理方法（目前UNOISE3也已经推出），并声明UNOISE2的结果堪比甚至优于DADA2。UNOISE2的原理比较简单，如下图所示，每个原点代表一个sequence，原点大小为相应丰度，绿色为正确的生物学序列，红色为含有若干错误的序列。左图内假设X为正确的生物学序列，周边序列按照与X的序列差异程度排序。与X足够临近、丰度又足够低的序列，很可能就是测序的错误，将被删除。Edgar还建议在对数据进行降噪处理时，应该pooling数据，而不是对单个样品分别分析。因为单个样品内丰度很低的序列在混样后并不见得很低，例如100个样品里各1条序列，混合后序列数可以提高2个数量级。

其他处理方式就不一一赘述了。虽然各有优劣，毫无疑问的是，理论上这些处理方式可以得到相似的多样性分布规律（pattern）等。而OTU聚类与序列直用主要的区别在于（Callahan et al. 2017）：

1）规避97%的相似度等阈值，可以提高检测的分辨率，尤其是那些遗传距离非常近（>97%）的物种，往往会因为被归入某个OTU而被雪藏；

2）OTU聚类有点类似一次性操作，不同研究之间的可比性比较不好，尤其是做荟萃分析时，可能需要把数据从头开始做，而直接用序列分析，就容易很多；

3）使用序列本身作为tag可能比OTU要稳定的一个原因是，序列本身具有一定的生物学意义，可以作为稳定的生物学标记，甚至不需要参考数据库，而OTU总归不能等同于species。

当然序列本身的使用也不是万能的，比如，使用marker gene分析时，不同的研究对象和研究环境，可能仍需要筛选相宜的marker及引物，不同数据之间的可比性依然是存在问题的。

在微生物生态学以外，随着高通量测序技术在生态学其他领域应用的不断拓展，类似的问题也已经并将继续影响其他领域内的结果发现与解释。Brown（2016）在使用metabarcoding对加拿大沿海港口进行入侵生物（浮游动物类）早期检测的文章里，比较了直接使用序列比对（individual reads）和聚成OTU后再进行序列比对两种方式。结果发现，序列直接比对检测到379种浮游动物，其中24种被认定为非本地种（NIS）；而OTU聚类后的结果发现，6种NIS物种未被检测到，另有1种属于鉴定错误。进一步的遗传分析显示，由于部分物种遗传距离非常近，因此容易被聚类成共享OTUs，而导致物种丢失。因此，直接使用序列进行比对可能会得到更可靠、更精确的结果。

使用高通量测序进行生物多样性分析时，另一个重要的挑战是现有的参考数据库（reference library）可能并不完善，尤其是形态学鉴定较为困难的生物类群。因此，规避物种划分（只关注pattern）成为替代选择。例如，2017年发表在Molecular Ecology Resources上的一篇文章，尝试了taxonomy-free的方法（Apotheloz-Perret-Gentil）计算硅藻指数（用以监测水体健康）。研究人员分别使用物种划分前后的eDNA数据计算硅藻指数，结果发现taxonomy-free的方法得到了准确性可观的评价。更重要的是，不进行物种划分的方法利用了95%的OTUs；而进行物种划分则只有35%的OTU可用，即其他的OTUs无法得到准确的比对结果，只能被舍弃。对于这种类型的分析，似乎不进行taxonomy assignment也是可行的。然而，在其他领域，如评估动植物多样性时，尤其是珍稀动植物或者入侵生物时，可能还是需要合适的方法获得物种水平的数据（如进一步完善参考数据库）。此外，在使用metabarcoding做食性分析或者动植物多样性监测时，遗传距离相近的动物/植物可能也会由于OTU聚类而被忽略。因此，如果条件允许，可以直接用序列进行比对，检测结果的可靠性。

综上所述，OTU聚类与否争议的根源其实在于，如何区分真实的生物数据与测序的错误。直接根据测序序列进行分析一定程度上确实会优于OTU聚类，结果的精确度和分辨率都会得到提高。测序技术和数据分析方法都在与时俱进，我们应该关注新的进展，但是也要尽量仔细比较和判断，谨慎选择适合自己研究的方法和模式。

参考文献

Amir A, et al. 2017. Deblur rapidlyresolves single-nucleotide community sequence patterns. mSystems 2:e00191-16.

Apotheloz-Perret-Gentil L, et al.2017. Taxonomy-free molecular diatom index for high-throughput eDNAbiomonitoring. Molecular Ecology Resources 17:1231-1242.

Brown EA, et al. 2016. Early detectionof aquatic invaders using metabarcoding reveals a high number of non-indigenousspecies in Canadian ports. Diversity and Distributions 1-15.

Callahan BJ, et al. 2017. Exactsequence variants should replace operational taxonomic units in marker-genedata analysis. The ISME Journal 1-5.

Callahan BJ, et al. Aug. 2015. DADA2:high resolution sample inference from amplicon data. bioRxiv preprint.

Edgar RC. Oct. 2016. UNOISE2: improvederror-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxivpreprint.

Edgar RC. Oct. 2017. Accuracy ofmicrobial community diversity estimated by closed- and open-reference OTUs.PeerJ.

Edgar RC. Sep. 2017. Updating the 97%identity threshold for 16S ribosomal RNA OTUs. bioRxiv preprint.

Thompson LR, et al. 2017. A communalcatalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature.

声明：以上为笔者个人阅读总结，希冀抛砖引玉之效。虽已尽力还原文献真实，个人感情色彩仍在所难免。为削弱误导效应，强烈建议对相关内容感兴趣的师长朋友们阅读原文，获取更详细、更准确的知识。文中难免有疏漏错误之处，恳请大家不吝赐教。谢谢。