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斯万特·帕博(Svante Pääbo)与古DNA研究

已有 1849 次阅读 2022-10-21 15:08 |个人分类:医药|系统分类:科普集锦

从考古和古生物遗骸中回收的DNA使我们能够追溯到过去,研究灭绝生物与其当代亲属的遗传关系。由于数万年来DNA降解以及微生物和当代人类的污染所带来的极端技术挑战,长期以来人们一直怀疑是否有可能从灭绝的人型中分析古代DNA

斯万特·帕博Svante Pääbo),这位瑞典遗传学家,古DNA研究的开创者,探寻尼安德特人基因组的先驱,因其卓越成就获得2022年诺贝尔生理学或医学奖。他成功地获得了我们最近灭绝的近亲尼安德特人的基因组序列。紧接着,他从一个小指骨标本中提取的基因组数据中发现另一种绝种的人,丹尼索瓦人。通过广泛的技术发展,斯万特·帕博在这一具有挑战性的领域制定了新的严格标准。

一、古DNA研究开端

13岁的帕博被母亲带到埃及旅游,这让帕博开始对埃及、木乃伊和金字塔着迷,从这时他就憧憬研究古文物和古文化。上大学时,帕博就选择了这一专业。但这一领域进展缓慢,人们总是重复地讨论同一物品或历史事件,他的父亲曾是一名医生,后来研究生物化学(1982年获得诺贝尔奖),受此影响,帕博进入了医学院,先选择基础研究,拿个博士学位,把医生职业作为备选。

在彼得森(Per Pettersson)的实验室,他研究腺病毒,并掌握了由科恩(Cohen)和博伊尔(Boyer)于1976年发明的基因重组技术。实验室的技术平台,为帕博研究古DNA提供了条件。

此时,帕博对于古文化和古文物仍兴趣不减,并与一个大学的博物馆馆长成为好朋友。并且,他关注到,有科学家展开了猿与人的血红蛋白比较,试图弄清楚这一蛋白的进化历程。也有科学家在显微镜下看到了木乃伊中的细胞。但帕博发现,没有人试图从古代生物(或人)的遗骸中提取DNA研究。帕博决定自己开始尝试从木乃伊中提取DNA。不过,在此之前,他要先做一个可行性的实验。

1981年夏天,帕博买了一块牛肝,把它放在烤箱加热,使它木乃伊化。帕博这个项目是秘密进行的,但烤箱里的怪味让整个实验室都觉察到了,他只得向大家公开说自己研究牛肝的木乃伊化。牛肝在50度的烤箱几天后,变得坚硬。他破碎牛肝,提取DNA,电泳并使用基因染色剂,最终在显微镜下,观察到了DNA的存在。

这个实验的成功,给了他信心,从木乃伊中提取DNA。他联系博物馆馆长朋友,朋友在他的劝说下,最终同意帕博从几个木乃伊上取下了几个肌肉和皮肤样本。帕博很兴奋,回到实验室开始提取DNA,但是这次却失败了。显微镜下看到的只是模糊的一片。这说明,木乃伊样本中的DNA在几千年的时间里已经降解了。

 

二、第一次正式的古DNA研究

失败后的帕博,重新研究腺病毒蛋白。但是他了解到,有经验的病理学家,可以给样本的细胞染色,同时也可以对样本进行基因染色,直接在显微镜下观察。但是,这需要更大量的木乃伊样本。

帕博再次找到朋友,要求取更多的木乃伊样本。朋友拒绝了。不过,他表示会联系一家东德的大型博物馆(位于东柏林)。在此期间,他研究细胞膜蛋白,发表了一篇《细胞》一作(1)。1983年夏天,在朋友的安排下,帕博获得了东德方面许可。他在那里,取了30多块木乃伊样本,通过显微镜,他首先在一块耳软骨样本上,发现软骨腔隙内仍存在细胞,这些细胞有正常的轮廓。接着又发现一个小孩子木乃伊的腿部皮肤,也保留正常细胞。帕博通过染色,确证细胞核内仍有DNA的存在。

只不过,他不确定这样木乃伊的真假,于是联系了一位碳测年的专家,检测一份木乃伊的样本。几个星期后,专家告诉他,这个样本有2400年的历史。帕博长出一口气,寄了盒巧克力给对方作为报酬。

接下来,帕博为这些样本提取DNA,并通过电池及染色确认。1984年,文章发表在东德的科学院期刊《古代》上,可惜无人问津。然后,他把文章又投递到《考研学杂志》,这个期刊审核时间较长,于1885年年底才发表。

在等待论文发表的期间,帕博深深感到,古DNA由于量太少,难以检测,必须扩增才能增加检测效果。于是他使用基因重组技术,把自己提取的古DNA克隆到细菌质粒中,筛选阳性克隆,再转染入细菌扩增。提取DNA后,用人的Alu核酸探针,在滤纸上与之结合,并把具有放射性的克隆测序(请实验室的测序专家),果然发现这是人的DNA,排除了细菌和其他生物。

198411月,《自然》杂志发表了加州大学伯克利分校艾伦·威尔逊(Allan Wilson的文章,从一头斑驴的遗体(灭绝100多年)中,提取DNA与斑马、马分别比较,通过三者的线粒体DNA比较,发现斑驴与斑马的血缘更接近,而与马较远。

受到这一文章的启发,帕博又把自己的文章寄给《自然》杂志(涉嫌一稿多投)。在此之前,帕博犹豫了很久,才与并不知情的导师沟通此事,并请导师以通讯作者署名。出乎意料,彼得森并没有批评帕博自作主张的研究,反而很高兴,他支持帕博投稿,还拒绝把自己列为作者之一,因为他全程不知情。

投稿后不久,《自然》寄来了校样稿。帕博激动地把复印件寄给威尔逊请其指点。威尔逊很快回信,他对帕博的研究很非常感兴趣,认为意义重大。不过,因为帕博没有主动在信中介绍自己,所以威尔逊以为他是一位“教授”,并在回信中希望能到“帕博教授”实验室进行半年的游学。帕博这才回信,解释自己尚未博士毕业,并主动向威尔逊申请,毕业后到其实验室读博后。威尔逊同意了。

 

三、古DNA研究方法的建立

1985年,《自然》发表了帕博的论文。也因此,冷泉港会议邀请他在1986年的会议做报告。PCR技术已经于1984年发明,发明人凯利·穆利斯(Kary Mullis)在这个会议上也做了报告。这一技术,即便样本中只有极微量的DNA,也可以通过引物和酶,不断复制扩增,极大丰富DNA的量。

返回欧洲后,帕博就利用这一技术,扩增古遗骸中的DNAPCR过程中,需要加热变性(使两条互补链分开变成单链),退火(降温使引物与单链DNA结合),延伸(DNA聚合酶以在引物末端开始复制单链DNA的互补链),每经历一轮循环,DNA的数量便会增加一倍。但是,当时的复制酶不耐热(钱嘉韵于1970年代在黄石公园火山温泉细菌中分离的耐热DNA聚合酶尚未应用到PCR),每一个PCR循环,都需要增加额外的酶。帕博浪费了几十管昂贵的酶,最终却没得到想要的结果,他判断样本DNA被污染(也有可能是他操作过程中被污染,因为每一次加酶,就多了一就污染机会)。从此他开始关心古DNA的污染问题。

等他到威尔逊实验室读博后期间,自动PCR仪开始投入使用,1989年,帕博在威尔逊实验室发表了用PCR技术研究古DNA的论文。因为大家竞争PCR仪器的使用,帕博还认识了他后来的妻子。

威尔逊团队,最早对线粒体DNAmtDNA)进行了限制性内切酶分析,这是人类DNA中最容易获得的部分,因为它存在于当前非洲和非非洲人群的每个细胞中的高拷贝数。通过对各地人群线粒体DNA的进化分析研究,威尔逊提出:非洲所有智人亚种都有共同的起源,这就是“走出非洲”人类进化理论的基础。

帕博也认为,由于mtDNA仅在母体一侧遗传,它仅包含16500个碱基对(bp),而核基因组仅包含30亿bp,所以在古遗骸中研究mtDNA是一种有效方法。

PCR可以把极微量的DNA扩增,而古DNA由于年代久远,大部分降解,即便研究mtDNA这种更高含量的部分,其数量也只是相对多一些而已。所以极微量的污染,就有可能使这种方法无效。博后毕业,帕博力排众议,在欧洲建了第一个古DNA研究的洁净室,并制订严格的规范。

在古代样品中观察到的DNA损伤类型包括由氧化过程(如胞嘧啶残基脱氨基为尿嘧啶)引起的核苷酸断裂和修饰。Päbo的团队想办法解决这一难题,他们开发了使用基于二氧化硅的纯化方法从古代样品中提取DNA的方法,并证明某些氨基酸的外消旋化程度可用于确定样品是否含有内源性DNA。因为古DNA损伤降解以及样品的污染,帕博认为,当时科学界一些从恐龙化石等样本中提取的DNA都是污染的结果,包括他本人在1984年在没有洁净损伤情况下完成的那篇《自然》论文,也不能排除污染问题。

 

四、尼安德特人基因研究

1856年,在杜塞尔多夫附近的尼安德特人山谷费尔德霍夫洞穴发现了尼安德特人的骨骼遗骸。这一“典型标本”的遗骸保存在德国波恩的莱茵博物馆。

早在之前,帕博在一篇文章中指出,可以成功分析数万年甚至十万年前的样本,而较旧的样本则被认为是无效的。然而,储存DNA的条件可以极大地影响衰变率,低温的破坏性较小。例如,对从永久冻土中发现的一只百万岁猛犸象牙齿的DNA就神奇地保存了下来。

帕博想证明,在古代骨骼中发现的微量残留DNA是否能够抵抗化学修饰和碎片化数万年之久,足以抵挡微生物生长和现代人类DNA污染。于是,1990年进入慕尼黑大学的帕博把目光投向尼安德特人。

他动用各种关系,得到尼安德特人的样本,他需要这些遗骸作为材料来源。最终在合作的基础上,他得到了一块尼安德特人的肱骨。

mtDNA比核DNA更容易在旧骨骼中存活,因为每个细胞都含有数百到数千拷贝的mtDNA,但每个核DNA片段只有两个拷贝(一个母体和一个父体)。帕博选择mtDNA作为其研究的第一个尼安德特人序列目标。

使用两个引物对人mtDNA控制区高可变部分的105bp片段进行PCR扩增,并对两个独立实验产生的片段进行克隆和测序。他的团队获得的初始mtDNA序列为61个核苷酸长,大多数克隆体都含有在当今人类中从未见过的变异。这使他确认,这是尼安德特人的序列。

不了保险起见,帕博团队又从一块新骨头上重复进行,结果相同。重叠的DNA片段随后被扩增、克隆和测序,以得到更长的序列。总共有123个克隆代表13个片段,每个克隆至少测序两次,帕博团队将尼安德特人mtDNA序列扩展到379个核苷酸。有一个外部实验室没有重复出帕博实验室的结果,帕博团队只得进行干预,指导对方特异性地设计引物,并采用更洁净的措施,最终印证了帕博实验室的结果。

他们将尼安德特尔mtDNA379个核苷酸与2051个人类和59个黑猩猩mtDNA序列进行了比较。该序列不属于欧洲、非洲、亚洲、美洲原住民和澳大利亚/大洋洲智人的变异。威尔逊团队的研究表明,黑猩猩、大猩猩和猩猩的遗传变异程度比现代人类要大,尽管它们的数量要少得多,这表明智人是从一个较小的群体扩展而来的。帕博团队对尼安德特人mtDNA序列的分析得出了类似的结果,表明这些个体来自一个经历了扩张的小群体。

系统进化树模型表明,今天的mtDNA基因库起源于非洲,与威尔逊之前的发现一致,携带这种mtDNA的共同祖先生活在120000150000年前。根据mtDNA分析,自尼安德特人和解剖学上现代人类共同祖先存在以来的时间估计是四倍;550000690000年。结果表明,尼安德特人在没有向现代人类贡献mtDNA的情况下灭绝了。

帕博团队对于尼安德特人的研究,进行了十几年,测了约70余个相关的样本。并且在2006年,帕博宣布了一个尼安德特人基因组计划,联合包括人口遗传学家等在内,成立了一个由大约50名科学家组成的联盟。帕博与454生命科学公司合作,通过焦磷酸测序这一高通量测序技术,最终2010年提交了第一份尼安德特人基因草图,所用数据来自克罗地亚一个洞穴中发现的3根尼安德特人的骨头。通过这一研究,帕博团队发现,数据表明,在欧亚大陆,有1-4%的人的基因组来自尼安德特人。

 

五、古DNA研究的深远意义

2008 年,科学家在西伯利亚南部的丹尼索瓦洞穴中发现了一块4万年前的指骨碎片。帕博带领的研究团队对其进行了测序。他们该 DNA 序列是独一无二的,这是一种此前未知的古人类,并命名为丹尼索瓦人。

帕博和他的团队提出,杰尼索娃是尼安德特人的姐妹群体,其人口分化时间是尼安德特人和人类共同祖先的一半至三分之二。在丹尼索瓦人与尼安德特人分化之后,尼安德特尔人的基因流到了今天非洲人的祖先。

凭借其开创性的发现,帕博建立了一门全新的科学学科,现在被称为古基因组学。从我们灭绝的人类亲属以及古代智人那里获得了大量的基因组序列数据,该领域正在迅速发展。2014年,帕博的团队使用杂交方法,从西班牙和克罗地亚的两个尼安德特人基因组的蛋白质编码部分富集DNA,并将序列与西伯利亚尼安德特尔人基因组一起分析。

除了帕博对已灭绝人类基因组的突破性发现外,对古代DNA降解的深入理解、高通量DNA测序技术和强大的竞争资源的结合,还导致了对古代现代人类基因组的检索。的发现被用来完善走出非洲模型,在这个模型中,所有现代人都可以以一条完整的线追溯到非洲。他的数据显示,古代现代人、尼安德特人和丹尼索瓦人之间发生了杂交,导致了今天人类中保留了少量的古代基因组片段。帕博创立的古基因组学,从技术层面,清晰地让人们了解自身进化与发展的历程。

参考文献:

1、Pääbo, S., Weber, F., Kämpe, O., Schaffner, W., & Peterson, P. (1983). Association between transplantation antigens and a viral membrane protein synthesized from a mammalian expression vector. Cell, 33(2), 445-453.

2、斯万特·帕博(Svante Pääbo),《尼安德特人》出版社: 浙江教育出版社,译者: 夏志 / 杨焕明。

3、Gunilla Karlsson Hedestam, Discoveries concerning the genomes of extinct hominins and human evolution.






 




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