一、摘要及关键词

【摘要】人们在研究烈性传染病病毒（如SARS病毒、埃博拉病毒等）时，往往会面临到危险性高、周期长、试验条件要求苛刻等诸多难题，而假病毒（pseudotyped virus）技术的兴起为解决此类问题提供了一种非常有效的研究手段。与野生型病毒相比，假病毒不仅可以模拟病毒感染早期过程，并且为复制缺陷型，仅具有单轮感染活力，安全性好，因此假病毒技术被广泛应用于抗病毒药物的筛选中。本研究首先通过分离深圳A/Shenzhen/406H/06病毒株，利用RT-PCR技术克隆HA、NA基因，并对其基因特征、分子遗传进化特点进行深入分析。然后将囊膜蛋白HA、NA基因成功克隆至真核表达载体CMV/R，在优化转染体系及转染条件后协同包装载体（pCMVΔ8.2）、转移载体（pHR-Luc）共转染293T细胞，从而成功制备整合HA、NA蛋白的具有广谱宿主范围假型逆转录病毒，通过电镜、免疫印迹（Western-blot）技术对假病毒进行鉴定。利用我们所构建的假病毒，系统评价中国内陆两例H5N1禽流感患者恢复期血清的中和效价，从而建立基于假病毒技术的安全、高效的H5N1禽流感病毒体外药物筛选技术平台。选用雄性Wistar大鼠，服药剂量按临床成人单位体重10倍，制备攻下组、解毒组、凉血组及扶正组共4种治法药物血清。为验证中药血清对HA蛋白是否具有直接抑制作用，本项目将中药血清与假病毒粒子直接孵育，然后使用假病毒感染靶细胞，发现中药血清对假病毒入侵靶细胞无明细影响。另外将含20%药物血清的培养基预先孵育靶细胞，然后使用假病毒进行感染，发现药物血清对靶细胞也无预防作用。为判断药物血清是否含有有效的NA抑制剂，在使用磷酸钙沉淀法共转染包装载体、转移载体、HA及NA真核表达载体至293T细胞后，48h换液后，使用含有20%复方中药血清的培养基孵育2h，然后观测假病毒粒子的感染活性的变化，结果药物血清对NA蛋白也无明显的抑制作用。最后我们也进行动物体内实验，在测定毒株半数致死量（LD50）后，对实验BALB/C小鼠进行攻毒，在病毒感染第2天起，每天上午、上午分别灌服一次中药，共6天，观测小鼠体重、死亡率变化，结果发现凉血组中药对小鼠具有55.6%的保护率。总结以上结果，4种治法的复方中药在体外不能直接抑制病毒，但在体内凉血法中药却可以通过调节机体免疫系统发挥对攻毒小鼠的保护效果。

【关键词】H5N1禽流感病毒；假病毒；药物血清

    二、研究计划要点及执行情况

1. 通过细胞培养的方法体外分离、扩增A/Shenzhen/406H/06病毒株，其中毒株样本来源为深圳人禽流感患者气管分泌物；分离病毒细胞株为犬肾细胞（MDCK），扩增至第三代即可出现显著细胞病变效应（CPE），收集细胞上清 -80°C保存。该部分实验在香港大学BSL-3实验室内完成。

2. 提取A/Shenzhen/406H/06病毒总RNA，通过RT-PCR方法克隆结构蛋白HA、NA基因，并将序列登陆至Genebank 中，并通过绘制系统进化树了解该毒株的遗传进化情况。

3. 将HA、NA基因克隆至真核表达载体，酶切鉴定准确后协同包装载体（pCMVΔ8.2）、转移载体（pHR-Luc）通过磷酸钙沉淀法共转染293T细胞，制备整合禽流感病毒囊膜蛋白的假型逆转录病毒，其中包括对HA、NA真核表达载体转染体系的探索及优化；

4. 整合HA、NA两个囊膜蛋白的假病毒的鉴定，其中包括蔗糖密度梯度离心后的Western-blot鉴定，从而明确假病毒粒子的分子量大小以及两种囊膜蛋白是否成功整合；再者通过观测荧光素酶活性判断新型假病毒粒子对靶细胞的感染活性，以及相对于单纯整合HA蛋白的假病毒感染活性的差异；。

5. 关于不同治法复方中药血清的制备在上海中医药大学肝病研究所完成。本项目共制备4种治法血清：攻下组、解毒组、凉血组及扶正组，实验动物选用雄性Wistar大鼠，服药剂量按临床成人单位体重10倍，对照组灌以等体积的生理盐水，采血时间按照文献报道。

6. 由于H5N1禽流感病毒入侵靶细胞主要通过HA与唾液酸α-2，3-半乳糖苷受体结合后胞吞介导，为验证中药血清对HA蛋白是否具有直接抑制作用，本项目将中药血清与整合HA蛋白的假病毒粒子直接孵育，然后使用假病毒感染靶细胞，从而判断中药血清对假病毒入侵靶细胞的影响。

8. 为验证中药血清是否含有有效组分或单体可以作用于靶细胞表面唾液酸α-2，3-半乳糖苷受体，本项目将含20%药物血清的培养基预先孵育靶细胞，然后使用假病毒进行感染，通过病毒感染后RLA值判断药物血清对靶细胞的预防作用。

9.在使用磷酸钙沉淀法共转染包装载体（pCMVΔ8.2）、转移载体（pHR-Luc）、HA及NA真核表达载体至293T细胞后，48h进行换液，使用含有20%复方中药血清的培养基孵育2h，然后观测假病毒粒子的感染活性的变化，从而判断复方中药血清是否含有有效的NA抑制剂。

10. 动物体内实验，在测定毒株半数致死量（LD50）后，对实验BALB/C小鼠进行攻毒，在病毒感染第2天起，每天上午、上午分别灌服一次中药，共6天，观测小鼠体重、死亡率变化，结果发现凉血组中药对小鼠具有55.6%的保护率。

    三、研究工作主要进展及所取得的成果

1. H5N1禽流感病毒的分离、扩增及分子遗传进化分析

流感病毒分离主要有两个方法：一是通过鸡胚进行扩增；二是通过细胞培养的方法进行扩增。本项目通过MDCK细胞进行A/Shenzhen/406H/06病毒株的分离及扩增培养，图1显示正常MDCK细胞形态圆滑，细胞间连接紧密，而进行扩增流感病毒后细胞出现脱落、固缩及坏死等明显CPE现象，提示病毒成功分离及扩增。采用RT-PCR扩增了病毒的全基因片段并进行测序鉴定，HA、NA、M基因在Genebank的登陆号分别为EF137706、EF137708、EF137710。对HA、NA基因进行同源性分析，系统进化树显示A/Shenzhen/406H/2006的HA基因与A/Anhui/1/05株同源性较近，而与香港97/02/03病毒分离株遗传距离较远（图2）；NA基因也同样与香港97/02/03病毒分离株不在同一进化枝中，与A/duck/Fujian/1734/05具有较高同源性。

图1  H5N1禽流感病毒感染MDCK细胞后出现的CPE反应

图2  基于HA基因的不同H5N1禽流感毒株系统进化树

    2. 成功构建整合A/Shenzhen/406H/06株HA、NA蛋白的假病毒

为验证假病毒粒子是否成功整合HA、NA蛋白以及准确判断新型假病毒粒子的分子量，本项目首先将新型假病毒粒子超速离心沉淀，然后进行蔗糖密度梯度离心，共分为12个密度梯度，Western-blot鉴定显示含NA蛋白的假病毒粒子主要分布于1.16g/ml、1.18g/ml及1.20g/ml密度层，见图3。

图3  整合HA、NA蛋白的新型假病毒粒子的蔗糖密度梯度离心

（注：其中含NA蛋白的假病毒粒子主要分布于8、9、10密度层）

3. H5N1禽流感假病毒粒子的电镜观测

为进一步明确整合HA、NA蛋白的假病毒粒子大小，我们进一步将转染后的293T细胞进行处理，利用磷酸钨染色后进行电子显微镜扫描，观测假病毒粒子的大小及形态（图4）。由于假病毒粒子基质蛋白来源于HIV-1，而HA、NA蛋白均属于囊膜蛋白，对于假病毒粒子的形态及大小无明显影响，所以形态学上本项目所构建的假病毒类似于HIV-1病毒颗粒。

图4  整合HA、NA蛋白的新型假病毒粒子的电镜扫描图

4. H5N1禽流感假病毒粒子感染活性的测定

使用假病毒感染MDCK、293T、CHO和Hela 4种细胞后检测Luciferase的相对活性（RLA），结果证明整合HA蛋白的假病毒均能感染上述4种细胞，表明所构建的假病毒具有感染活力，且具有广泛的宿主范围（图5）。

图5  H5N1禽流感假病毒对不同靶细胞的感染活性

5. 基于假病毒技术的H5N1禽流感病毒体外中和试验技术平台的建立

我们在征得H5N1禽流感康复患者同意的情况下采集恢复期血清，其中一份来自2006年安徽省阜阳市病例王某，一份采自2006年广东省深圳市病例江某。将患者血清按12个梯度进行稀释，分别与整合NA蛋白的深圳株、泰国株假病毒进行中和反应，并以VSV-G假病毒作为阴性对照，如图6所示，深圳恢复期血清对自身分离的深圳株假病毒RLA值的50%抑制浓度（IC50）约为1：10240，而对泰国株假病毒中和效价显著低于深圳株，IC50介于1：160~320，而对VSV-G假病毒基本无中和能力。图7则显示安徽恢复期血清对深圳株假病毒的中和效价高于泰国株，其中对深圳株假病毒的IC50介于1：5120~10240，低于深圳患者自身恢复期血清的中和能力（1：10240，图7）；而对泰国株假病毒的IC50介于1：2650~5120，则显著高于深圳恢复期血清。

图6  深圳籍H5N1禽流感患者恢复期血清对多株整合NA蛋白的假病毒的抑制作用

图7  安徽籍H5N1禽流感患者恢复期血清对多株整合NA蛋白的假病毒的抑制作用

6. 4种治法复方中药血清对HA蛋白体外抑制试验

通过将假病毒与中药血清孵育后再感染细胞，并以HA蛋白特异性中和抗体2B4为阳性对照，从图8可以看到，当使用中和抗体2B4与假病毒孵育后，在50μL、25μL及12.5μL的剂量条件下均可以抑制假病毒的感染活性，从而证实利用假病毒技术筛选药物的方法的有效性及可行性。然而与对照组相比，4种复方中药在不同剂量条件下对假病毒感染活性均无明显抑制作用，提示复方血清并不含有抑制HA蛋白的有效组分或单体。

图8  4种治法中药血清对HA蛋白的抑制作用

    7. 4种治法复方中药血清对唾液酸α-2，3半乳糖苷受体的影响

为判断药物血清中是否含有有效单体作用于禽流感病毒唾液酸α-2，3半乳糖苷受体而竞争性抑制假病毒颗粒入侵，本研究在将假病毒感染靶细胞之前，预先使用药物血清处理靶细胞，之后观测假病毒对靶细胞的感染活性。与对照组相比，4种药物血清均未能发挥有效的预防作用（图9），提示复方血清也不含有竞争性结合唾液酸α-2，3半乳糖苷受体的有效组分或单体。

图9  4种治法中药血清对唾液酸α-2，3半乳糖苷受体的影响

      8. FACS分析复方中药血清对HA蛋白的影响

为进一步判断药物血清对HA蛋白的影响，我们以未转染HA质粒的293T细胞作为空白对照（图10A），与空白对照相比，转染HA质粒但未加入药物血清的293T细胞峰值明显偏移（图10B），从而证明HA质粒被成功转染并在细胞膜表面表达HA蛋白。转染HA质粒并加入不同药物血清的293T细胞均可表达HA蛋白（图10C-攻下组；10D-解毒组；10E-凉血组；10F-扶正组），并且峰值偏移率与对照药物血清组基本一致（图10G），从而提示4种药物血清并不能抑制H5N1流感病毒HA蛋白的表达。

图10  采用流式细胞术分析复方中药血清对HA蛋白的影响

9. 4种治法复方中药血清对NA蛋白体外抑制试验

为验证复方中药血清中是否含有可以抑制NA蛋白的有效单体，我们借助假病毒体外筛选平台，于转染48h后加入终浓度为20%的中药血清孵育2h，然后检测RLA值。结果发现4种组方及合方的RLA值与正常组的差异无统计学意义（P>0.05，图11），提示本项目所选取的中药复方并不能有效抑制NA蛋白所介导的病毒粒子释放。

图11  不同复方中药血清对假病毒NA蛋白的抑制作用

      10. FACS分析复方中药血清对NA蛋白的影响

我们通过FACS判断不同复方中药血清对NA蛋白表达的影响。由于缺乏有效的NA特异性单克隆抗体，所以我们在构建NA真核表达载体过程中，在NA序列内部加入Flag标签，因此可以使用抗-Flag特异性单抗即可判断NA蛋白的表达。如图12所示，转染NA载体的阳性对照293T细胞（图12B）较空白对照（图12A）有明显峰值偏移，提示NA蛋白不仅可以锚定在细胞膜表面，而且凭借所加入的Flag标签可以有效判断NA蛋白的表达。然而与阳性对照相比，正常组（图12C）、解毒组（图12D）、扶正组（图12E）、凉血组（图12F）、攻下组（图12G）以及合方组（图12H）的峰值偏移率基本一致，从而提示不同复方中药血清未能有效抑制NA蛋白的表达。

图12  采用流式细胞术分析不同复方中药血清对NA蛋白表达的影响

（注：A. 空白对照组；B. 阳性对照组；C. 正常组血清；D. 解毒组；E. 扶正组；F. 凉血组；G. 攻下组；H. 合方组）

11. 4种治法复方中药体内对攻毒小鼠的保护作用

用戊巴比妥钠麻醉BALB/c小鼠，经滴鼻感染10×LD50（10倍半数致死剂量）的H5N1禽流感病毒30μL，2 h 后开始灌胃给药，每日2 次，共给药6 d 。正常对照组和病毒对照组给予PBS，阳性对照组给予奥司他韦，用药等效剂量均按成人临床日用量与体重折算系数比进行计算。所有小鼠每日在灌药前称量体重，并记录死亡数，观测期限截止至病毒感染后2周，大致流程参照图13。结果证实4种复方对攻毒小鼠体重无明显影响（图14），凉血组中药对小鼠具有55.6%的保护率，其他治法中药保护效果不理想（图15）。

图13  BALB/C小鼠体内攻毒实验操作流程

图14  4种治法复方中药对攻毒小鼠体重变化的影响

图15  4种治法复方中药对攻毒小鼠生存率的影响

    四、存在的问题、建议及其他需要说明的情况

    在开展本项目的过程中，H5N1禽流感病毒的体外分离、基因组分子克隆、假病毒的构建及鉴定、基于假病毒技术的体外药物筛选平台的建立都非常顺利，所构建的假病毒不仅整合HA、NA蛋白，并且对多种靶细胞具有感染活性，效价可以达到10*6，完全满足中药体外筛选需要。

    中药复方血清制备一直也是一个具有颇多争议的问题，由于中药成分复杂，对复方进行质控分析更是难上加难。本项目中所采用药物血清制备方案，主要借鉴上海中医药大学肝病研究所在该领域研究的经验。当然该部分实验若要做的更为细致，还需要对采血时间、药物剂量等多方面进行优化。

    本项目体外试验研究发现，4种治法复方药物血清对HA、唾液酸α-2，3半乳糖苷受体及NA蛋白均无抑制作用，从而提示中药对H5N1禽流感病毒本身并无影响，这与国外报道基本一致。动物体内实验发现，4种中医治法中，只有凉血法可以提高攻毒小鼠的生存率，从而提示尽管部分中药对H5N1禽流感病毒无抑制作用，但却可以通过调节机体免疫系统来达到控制病情进展的目的，表明中医药对于免疫调节具有重要意义，这无疑是未来开展中医药研究的一个重要方向。