2015 Scientific Reports：Omics-based interpretation of synergism in a soil-derived cellulose-degrading microbial community 

2015 Scientific Reports：土壤纤维素降解微生物群落协同作用的组学解释

摘要

对自然界如何解决难降解生物量的问题进行全面的了解，可能有助于开发出更高效的生物净化工艺。在这里，我们解析了从土壤中富集的纤维素分解微生物联合体（F1RT）的基因组和蛋白质组信息。对F1RT中所有7个未培养的系统发育类型的重组细菌基因组的分析表明，其组成微生物在纤维素降解和其他重要代谢过程中起协同作用。F1RT中的微生物在纤维素分解中存在物种间合作，这些微生物编码和表达包括胞外纤维素体和分泌的游离酶系统的互补酶。7个F1RT系统类型的代谢重建预测了一个更广泛的基因组理论基础，即这个特殊的群落是如何发挥作用的，以及为什么自然界中的生物质转化依赖于结构和合作的微生物群落的可能原因。

前言

传统化石燃料的利用通常与全球环境问题和供应问题有关，强调需要可持续的生物燃料替代品。纤维素，地球上最丰富的可再生生物质基质1正受到越来越多的关注2，3，然而其工业规模转化为生物燃料受到结构顽固性和可用生物催化剂缺乏的阻碍。目前对纤维素转化酶系统的研究主要集中在单个微生物中游离酶系统4和/或纤维素体5-7的能力。然而，纤维素在自然界的转化很可能得益于微生物联合体或“微生物群”8-10中的协同作用。这一点以前在实验室中已被阐明，由五个分离菌株（命名为SF356）构建的确定的混合培养物，它们共同降解纤维素，同时保持稳定的种群结构和随着时间的推移改善的功能。

由于富含纤维素的植物生物量在土壤环境中不断循环利用，因此大量高效纤维素降解机器应该存在于土著微生物中，可能包括迄今为止隐藏的降解机制。最近，宏基因组测序已经能够深入描述复杂微生物组，特别是在植物生物量转化方面，包括消化系统8、10和自由生活的生态系统9。更重要的是，目前这种测序工作的可达到深度，加上分类“binning”软件的进展，有助于重建代表目前土著微生物组中尚未培养的微生物的基因组8,13。基于这些概念，我们使用了一套独立于培养的“组学”技术，分析了从自然土壤样品中富集的一个熟悉的低复杂度纤维素降解微生物群的基因组潜力和功能协同作用。

结果

F1RT菌群的发现和结构描述。从中国韶关不同地点采集了5份腐殖化土壤样品，以滤纸降解为指标分析了它们的纤维素分解能力（补充图1）。为了避免土壤微生物组固有的高物种复杂性，在选择性有氧培养基上，采用连续稀释、涂布和重复继代培养的方法，对表现最好的样品进行富集策略。尽管有这些大量的努力，并没有获得纯菌。相反，我们最终得到了一个联合体（以下称为F1RT），最初在一个选择板上显示为一个菌落（补充图2）。F1RT在随后的几十次传代中功能稳定，能够完全降解滤纸（补充图3）。16S rRNA基因测序分析表明，它是一个包含7个个体系统类型的混合群体，以不同的相似值（92.4-99.8 ID%）与需氧和厌氧物种相关联（rrs聚类：RC1-7，表1）。考虑到F1RT中的系统发育和假定的表型变异，采用了一种宏基因组和基因组分箱方法来恢复接近完整的基因组，从而可以对所有7种系统发育类型的代谢能力进行整体解释。利用Illumina技术，我们恢复了12.8GB的F1RT宏基因组序列，稀疏曲线（补充图4）表明测序深度足以进行从头组装。大约90.1%的高质量序列（10.23 Gb）被组装成总共3930个支架（长度≥500 bp，平均长度为6.7 kb），总计为26.51 Mb（补充图5）。使用GeneMark 预测了27532个长度≥100bp的开放阅读框（ORF）。

表1 |描述为16S rRNA OTUs（rrs簇：RC）和草图基因组箱（F1RT簇：FC）的F1RT联合体的一般特征

†推断两个物种之间关系的值定义为TETRA≥99。

*RC和FC的近亲的系统发育分析使得这两个数据集之间有可能存在关联。红色表示根据梭菌属（补充图10）。的系统聚类推测的假定直接RC-FC关联。白色（RC5，RC6和FC6，FC7；梭菌属）和蓝色（RC4，RC7和FC3，FC4；杆菌属）框表示非直接关联，其中聚类分析未使特定的RC-FC关联（例如，FC3可能与RC4或RC7关联，有关详细信息，请参阅补充说明3）。在这些情况下，最好的可用聚类被用来推测预测性关联。

**生物体的名称是根据已知的代谢特性来标记的，这些特性得到了文献中实验观察的支持；注意，并不是对于每种生物所有潜在的特性都被分析过：a:好氧，aa:厌氧，ac:醋酸盐生产者，c:纤维素分解，cel:检测到纤维素体成分，ch:酪蛋白水解，et:乙醇生产者。

为了使F1RT系统发育类型的基因组分析成为可能，使用基于保守单拷贝基因14的序列覆盖、基于马尔可夫模型的四核苷酸频率15和贝叶斯分类16的组合分箱合方法，从组装的宏基因组支架（FC1–7；表1，补充说明1，补充表3）重建7个未培养微生物的基因组。与GenBank提供的完整基因组进行比较（补充说明2）时，我们采用了与前期8所述相同的工作流程，评估分箱基因组的覆盖度。分箱基因组的完整性估计表明，所有7个基因组都是具有低冗余的保守单拷贝基因（即高“真实性”）的，接近完整的原始基因组，尽管对于FC7，数据表明完整性和真实性水平略低（补充图9；补充表4）。基因组组装覆盖数据表明，FC1、FC2和FC3是F1RT中最丰富的系统发育类型（表1，补充图7）

草案基因组箱FC1-7被发现缺乏16S rRNA基因，可能是由于16S rRNA操纵子的重复性，这往往导致细菌基因组中的组装问题。TETRA、ANI和AAI测量17被用于鉴定FC基因组的分类，但未能指明物种归属，这意味着该群落中的所有系统发育类型迄今尚未测序（表1，补充表8）。因此，我们比较了为FC和RC收集的数据集的不同分类隶属关系，以使F1RT草案基因组箱（FC）和操作分类单元（OTUs；RC）之间假定关联（表1，补充说明3）。FC和RC的比较表明，所有7个簇都隶属于厚壁菌门，其中5个簇隶属于梭状芽孢杆菌目，2个簇隶属于芽孢杆菌目（表1）。从RC系统类型、最近的RC亲缘关系和最近的FC亲缘关系（由TETRA匹配确定）中对梭状芽孢杆菌目相关16S rRNA序列进行的额外系统发育分析显示了不同的系统发育聚类，用于识别“直接”RC-FC关联（补充注3）。FC2与热纤梭菌Clostridium thermocellum（TETRA系数为50.95）的基因组相似性最接近，推测隶属于厌氧纤维素分解土壤细菌Clostridium straminisolvens（RC3: 16S rRNA同源性99.6%）有关。FC1与热纤梭菌Clostridium thermocellum（TETRA系数为50.92）的基因组相似性也最接近，但可能隶属于Clostridium thermosuccinogenes（RC2: 16S rRNA同源性99.1%；表1）和Clostridium sp. FG4（16S rRNA同源性99.3%）。有趣的是，后一种是一种低聚糖发酵厌氧菌，在SF356富集物12中发现与C. straminisolvens共存。FC5可能隶属于产孢梭菌Clostridium sporogenes（RC1）。FC6显示的低TETRA系数和FC7的不相关聚类阻碍了与RC聚类及其附属物种的直接关联。在消除的过程中，FC6和FC7“非直接”与隶属于Cellulosilyticum lentocellum（RC5: 16S rRNA同源性92.4%）和Tissierella praeacuta（RC6: 16S rRNA同源性94.1%）的剩余梭菌RC簇中的任何一个相关。类似地，推测与芽孢杆菌目（FC3和FC4）相关的两种F1RT系统类型与隶属于同一目的好氧Brevibacillus borstelensis的RC簇中的任何一个非直接相关（RC4和RC7，表1）。对于非直接关联，可用的最佳聚类用于推测一个预测关联（表1）。

基于组学的F1RT纤维素降解能力的解释。F1RT联盟所展示的纤维素分解能力及其某些组成系统类型与纤维素分解梭菌的联系（表1）使我们最初关注F1RT编码和利用纤维素体结构的潜力。首先在C.thermocellum5,7中描述的纤维素体是一种复杂的多酶机器，它是由支架上的I型黏连蛋白模块和附着在每个酶亚单位上的I型dockerin模块之间的蛋白质-蛋白质相互作用组装而成的。由特定的支架和/或细胞表面蛋白编码的II型黏连蛋白和II型dockerins之间的相互作用，可能将纤维素体结构与细胞表面和/或其他纤维素体（多纤维素体）6联系起来。我们检测到74个假定的dockerin，由69个I型和5个II型域（域结构：补充表9-11，域比对：补充图11）组成。共有27个假定的黏连蛋白域分布在13个支架编码的ORF（域结构：图1A，补充表12，域比对：补充图12）。所有的纤维素体ORF都隶属于FC2，其基因组与已知的纤维素体细菌C.thermocellum的基因组最为相似。值得注意的是，用于基因组比较的TETRA系数为0.95，即远低于表明物种归属的阈值（0.9917）（表1）。鉴于FC2基因组的不完整状态，未尝试对F1RT纤维素体的结构组装进行详细的预测。不管怎样，在FC2支架（图1A）中观察到的大模块可变性以及I型和II型黏连蛋白/dockerin模块的鉴定表明存在大量不同的（多）纤维体组合。

图1 | F1RT联合体中确定的纤维素体亚基的示意图。

（A） 在F1RT宏基因组中鉴定的各种支架的Dockerin目录和模块化结构。推测支架属于FC2的草案基因组分箱。注意，这是一个部分的基因组分箱，意味着一些蛋白质是不完整的，我们只能获得纤维素体蛋白的一个子集。所有纤维素体GH域的结构概述见补充表10。缩写：GH，糖苷水解酶；CBM，碳水化合物结合模块；Cu，铜；aa，氨基酸。

（B） 通过对F1RT联盟产生的可溶性蛋白质-蛋白质复合物的宏蛋白质组学分析预测的多纤维素体装配的假设性示例（参见补充图14，补充表21，“带10”）。蛋白质组学实验中未检测到阴影结构（对应GL0023450）。然而，将ORF GL0026964（缺少39末端）与C.themmellum的先锋CipA支架进行比较，可能表明该蛋白编码GL0023450（缺少59末端）中的必需II型dockerin；见正文。

为了发掘F1RT中编码的碳水化合物活性酶，我们使用CAZy数据库18作为参考，识别了348个假定的糖苷水解酶（GH）结构域（GH摘要：补充表13）和227个假定的碳水化合物结合模块（CBMs）（补充表9）。共鉴定出50个GH结构域和46个ORF，这些ORF也编码1型dockerin结构域，因此这些GHs被认为是纤维素体；GH结构域中的27个被预测为纤维素酶（GH5、GH9、GH44、GH48、GH74；图1A）。额外的纤维素水解（GH）和结合（CBMs）能力似乎针对木聚糖（GH10、GH43、CBM6、CBM22）、甘露聚糖（GH26、CBM35）、木葡聚糖（GH16、GH74）和β-葡聚糖（GH16、GH55、GH81）（图1A）。所有GH结构域中约有86%被认为是非纤维素体，但在含有高覆盖度纤维素体FC2中，根据纤维素体在纤维素降解中的预期重要性，预测为纤维素酶（包括内葡聚糖酶和外葡聚糖酶）的77%被预测为纤维素体19。一些系统发育类型包含大的GH谱，包括纤维素酶，但没有任何纤维素体结构域，这表明它们的糖解能力通过使用自由酶系统而扩展（补充表13）。FC6和高覆盖度FC1系统类型编码综合（分别为53和123个GH结构域）但稍有变异的糖苷水解酶目录，其中包括对半纤维素的推断活性（如GH8、GH26、GH43），表明F1RT具有降解异质和复杂半纤维素底物的能力（图2，补充表13）。FC1也被发现编码假定的内葡聚糖酶（GH5和GH9），推测其在纤维素转化中也可能起作用。预测FC3、FC4和FC5不能降解纤维素和半纤维素，但发现它们编码降解GH的寡糖结构域，如GH3β-葡萄糖苷酶和GH96纤维二糖磷酸化酶。

图2 |基于F1RT富集物中假定的物种间合作总结的假设性网络模型。

利用途径分析（补充表24）及与含有C. straminisolvens 的SF356富集物的的结构比较，对F1RT联合体的糖化和下游代谢进行预测。系统类型FC3和FC4被预测为（兼性）需氧菌，因此可能通过利用PCS介质中的底物消耗氧气。至关重要的是，这提供并随后维持了缺氧环境（灰色阴影），FC1-2和FC6通过在纤维素体和/或游离酶系统中使用不同的糖苷水解酶（GH）降解纤维素和各种半纤维素基质所需的缺氧环境。代谢重建表明，所有厌氧系统类型都能发酵纤维素和半纤维素水解产生的各种糖。主要发酵终产物为乙酸、乙醇和琥珀酸（粗体文本）以及甲酸和乳酸。FC3和FC4能够利用乙醇和乙酸（乙醛酸循环）以及琥珀酸（琥珀酸到细胞色素氧化酶的电子转移）。选定的糖苷水解酶（GH）家族适用于FC1-2和FC6；完整的糖苷水解酶（GH）目录见补充表13。有关FC1-7的详细路径分析，请参阅补充表24

对F1RT联合体进行了宏蛋白质组学分析，以说明哪些系统类型能够有效地产生纤维素分解机器和其他多糖降解酶。这种方法发现了大量与细胞外和细胞壁相关的纤维素体蛋白和游离酶GHs（补充说明4）。此外，研究还表明，不同的联合体成员以不同的方式对联合体的酶潜能做出贡献（图2，补充表S15-18）。从所有7个草案基因组中检测到游离酶GHs，但与FC1和FC2相关的非纤维素体GHs最为丰富，包括假定的纤维素酶（GH48、GH9、GH5）和半纤维素酶（GH10、GH11、GH29、GH51）。（补充表S17-18）。在细胞外部分也检测到了纤维素体蛋白，包括一个多II型黏连蛋白编码支架（GL0004812，图1A），该支架不编码任何细胞锚定域（即SLH20），表明其参与了无细胞的纤维素体。GL0004812（7种II型黏连蛋白）的域结构与C. thermocellum 的Cthe_0736支架相似，虽然有人认为其可以形成无细胞的胞外多纤维素体复合物6，但其功能作用相对未知。利用天然聚丙烯酰胺凝胶分离的细胞外纤维素体复合物的NanoLC-MS/MS分析，经常共同检测到GL0004812和一个多I型支架（GL0026964），该支架类似于C. thermocellum的先锋CipA支架（补充图14，补充表21-22）。虽然不完整的GL0026964似乎缺少与GL0004812互作所需的II型dockerin，但我们预测它可能在ORF缺失的39个区域上编码必要的域，类似或可能相同于在同样不完整的GL0023450上编码的域（图1A）。这一预测得到了以下观察结果的支持：GL0026964和GL0023450分别与C. thermocellum的CipA支架上的N-和C-末端区域对齐（acc:YP_）。整理这些信息，我们假设GL0004812和GL0026964可以相互连接，形成一个不附着在细胞壁上的多纤维素体组装（图1B）。在PAGE凝胶带中检测到的酶亚基主要由属于GH48和GH9家族的纤维素体纤维素酶组成，而也检测到了纤维素体GH5、GH8、GH10、GH18、GH26、GH44和GH74结构域（补充表21-22）。

F1RT的代谢重建预测了物种间合作的基因组原理。与系统发育相关的F1RT代谢重建相比，F1RT最显著的特征预示着一个基因组衍生的物种间合作的合理性。与系统发育相关的纤维素分解细菌C.straminisolvens、C.thermocellum和C.lentocellum相比，F1RT最显著的特点是它能在有氧培养基中降解纤维素，然而，这些已知的纤维素分解梭菌个体需要严格的厌氧培养基生长和纤维素转化。Kato等人在纤维素降解菌群（富集SF356）方面的开创性工作中证明，C. straminisolvens的纤维素分解效率在其他需氧和非纤维素分解厌氧系统类型11,12的存在下受到刺激。尽管SF356和F1RT是从独立采集的样本中富集出来的，但它们的结构相似，包括FC2与C. straminisolvens的亲缘关系，FC1与Clostridium sp. FG4的亲缘关系（99.3%的亲缘关系），以及FC3和FC4与短杆菌属的亲缘关系。

我们的F1RT宏基因组数据集允许对这些关于细菌共存的有趣观察进行广泛的基因组分析（在图2中总结）。代谢途径的基因组规模重建揭示了F1RT系统发育类型的功能对比，并提出了几种共营养机制。（图2，补充表24）。与SF356类似，对氧气需求的分析区分了Brevibacillus的系统类型FC3和FC4，它们是一种（兼性）需氧菌，在F1RT富集培养基中利用存在或产生的营养物时可能消耗氧气（图2，补充表24）。尽管C.straminisolvens（类似于FC2）是SF356中唯一的多糖降解菌，但我们的数据表明，F1RT中五种厌氧系统类型中的三种通过利用纤维素体（如FC2）和游离酶系统（如FC1和FC6）进行植物多糖的水解（图2）。特别是，在F1RT宏蛋白质组分析中检测到与FC1相关的GH5内葡聚糖酶（补充表17）。这表明FC1比其对应的SF356中的 Clostridium sp. FG4对糖解的贡献更大，后者仅被认为能够发酵低聚糖12

假定转运体（补充表25）、β-葡萄糖苷酶（即GH1、GH3；补充表13）和纤维二糖磷酸化酶（GH94；补充表13）的鉴定表明，所有F1RT系统类型都能够“下游”代谢利用释放的纤维二糖精。由于葡萄糖和纤维二糖已知能抑制纤维素酶和纤维素体形成21，它们被非纤维降解系统发育类型如FC5和FC6利用可能有助于保持F1RT连续解构纤维素的能力（图2）。对重构途径的分析进一步表明，厌氧菌的系统发育类型因其能够发酵到乙醇、乙酸盐和琥珀酸盐等最终产物的糖而不同（图2，补充表24）。与短芽孢杆菌相关的系统类型FC3和FC4似乎能够将乙醇和乙酸转化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A是兼性厌氧菌和需氧菌常用的乙醛酸循环的主要输入（补充表24）。除了提供微生物共存的营养基础之外，非纤维素分解细菌对醋酸和琥珀酸的预测消耗（图2，补充表24）预计将减轻酸积累对pH值的负面影响，已知酸积累会对厌氧梭菌降解纤维素产生负面影响。

讨论

我们对微生物植物生物量降解的累积认识是建立在对单一纤维素分解菌及其酶的实验室性能评估基础上的。然而，这并不能反映自然存在的纤维素分解生态系统的真实能力，它们利用一个联合体内的同向相互作用来包裹多糖水解和下游代谢。在这里，我们利用DNA测序和计算生物学技术的最新进展来描述一个细胞分解联盟中所有尚未培养的成员的基因组和蛋白质组。所有F1RT系统类型的预测性代谢“蓝图”分析提供了F1RT联合体的功能、为什么它抵制最初的需氧培养以及为什么它显示出与独立产生的SF356富集物的结构相似性的基因组基础。此外，我们的“组学”分析首次允许从未培养的细菌中重建纤维素体，并指出细胞外（多）纤维素体的存在，这是纤维素体“范式”的一个鲜为人知的方面。此外，我们的分析表明，在一个联盟中，不同的系统发育类型可能同时操纵于纤维素体和游离酶系统。事实上，最近的体外研究表明，由于两种酶系统使用不同的机制与微晶表面相互作用19,23，重组纤维素体与游离酶之间存在协同作用。我们的发现表明，这种多系统降解纤维素的策略可以相信存在于自然发生的微生物群落中。F1RT的功能能力，结合观察到的与之前所描述的SF356联合体的结构相似性，表明F1RT样种群在天然纤维素降解土壤生态系统中起着关键作用。这一假设的验证将为更广泛地理解这类菌群的影响提供重要的见解。

方法

从中国韶关市采集土壤样品，对其降解纤维素的能力进行了测试和比较。利用含有滤纸的选择性培养基驯化和简化了最佳富集，在鉴定为纤维素水解有效的特定富集（称为F1RT）之前进行了大约64次连续传代培养。

F1RT作为一个具有功能稳定性的联合体，通过基于培养的方法没有得到进一步的简化。因此，我们应用宏基因组学的方法来解码和重建F1RT的遗传成分，并观察推测整个群落的纤维素酶谱。此外，宏蛋白质组学被用于分析蛋白质-蛋白质复合物，以验证关于F1RT的纤维素降解能力的预测注释。最后，进行更广泛的代谢途径分析，以预测F1RT联合体内的同营养关系。补充资料中提供了完整的方法和相关参考资料。