2014年9月23日，斯氏按蚊(Anopheles stephensi)基因组序列发表在Genome Biology上。文章结合Roche 454、illumina HiSeq 2000以及PacBio平台综合测序、组装的策略。

一、取材

印度斯氏按蚊(Anopheles stephensi)实验室内自然繁殖多代。取五十多只雄性斯氏按蚊和雌性斯氏按蚊提取基因组DNA和总RNA。gDNA提取试剂盒为Qiagen (Hilden, Germany) DNeasy Blood and tissue kit；总RNA提取试剂盒为mirVana RNA isolation kit (Life Technologies, Carlsbad, CA)。

二、基因组测序策略

1)454 FLX Titanium测序：1个shotgun文库SE测序；3Kb、8Kb、20Kb mate pair文库测序；测序深度为19.4×；

2)Illumina HiSeq 2000 100PE：雄性gDNA,1个~200bp shotgun文库测序1个lane；测序深度为86.4×；

3)PacBio v1测序：雄性gDNA，测序10个cell；测序深度为5.2×；

4)Sanger测序：7,263 BAC-ends。

三、基因组组装

1)454 reads结合Newbler单独组装；

2)454 reads和illumina raw reads结合Newbler进行组装：this resulted in a worse assembly  than 454 alone；但是运用这个策略组装Solenopsis invicta基因组效果很成功；

3)先组装illumina reads，再将454 reads进行拼接：

 a.先结合Celera assembler组装illumina reads获得Illumina pseudo-454 reads assembly：组装获得41,213 contigs spanning 212.8 Mb，该组装结果contig N50为16.8kb；

 b.再将该结果通过Newbler 2.8和454 reads进行组装：组装获得23,595 scaffolds spanned 221 Mb，scaffold N50为1.34 Mb；

 c.结合PacBio reads填补gaps：首先通过Celera pacBioToCa pipeline结合454 reads对PacBio raw reads进行错误校正，获得0.88 Gb校正好的PacBio reads；再结合Pbjelly填补gaps。一共补洞1310个，长度达5.4Mb。

 d.结合BAC-ends进一步scaffolding：(BAC文库大小约120kb±70kb)，结合Bambus scaffolder进一步将3,527 BAC-end pairs序列进行scaffolding，共获得46 links定位22 scaffolds, 将scaffold N50从1,378 kb增长至1,572 kb。

四、验证组装结果

1)结合CEGMA对组装结果中存在的真核生物核基因（Core Eukaryotic Genes）来验证组装结果：248个真核生物核基因中有96.37%是包含在该组装结果中的；97.89%显示为是部分被包含其中的。

2)BAC-ends验证：结合NUCMER将BAC-ends比对回组装结果进行验证，仅唯一比对、99% identity、 >95% coverage的才用于后续统计中，比对率为21.6%。

3)ESTs序列验证：ESTs序列是从NCBI和VectorBase中下载的，去除ESTs中的载体序列等污染序列后再结合GMAP比对至组装结果上，35,367 of 36,064 ESTs比对上，其中26,638至少覆盖95%(>98%identity)。

五、构建遗传图谱

1)A physical map of the An.stephensi genome was created from FISH on polytene chromosomes；

2)227 probes对86个scaffolds进行定位；被定位的86个scaffolds包含137.14Mb组装子序列信息，覆盖比例为62%。

六、基因注释

通过同源比对注释和从头注释获得11,789各蛋白编码基因。

七、转录组测序

共11个总RNA样本开展转录组测序：0–1, 2–4, 4–8, and 8–12 hour post-egg deposition embryos, larvae, pupae, adult males, adult females, non-blood-fed ovaries, blood-

fed ovaries, and 24 hours post-blood-fed female carcasses without ovaries。

重点分析了与免疫、唾腺分泌有关的功能基因。

八、基因家族比较分析：An. stephensi and An. gambiae。

九、重复序列分析

十、基因组图谱：包括基因、TEs、短串联重复序列基于遗传图谱在每条染色体上的分布情况

十一、染色体臂上异染色质的分布情况

十二、Y染色体分析

十三、基因共线性和进化分析

十四、比较果蝇和按蚊染色体的进化速率

十五、基因组遗传多样性分析

蚊类物种基因组测序信息汇总-2015.xls

文献下载：Genome analysis of a major urban malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.pdf

文献链接：http://genomebiology.com/2014/15/9/459/abstract。