磷壁质酸与磷壁酸的结构

大多数革兰氏阳性细菌的细胞壁含有磷壁酸，磷壁酸是由糖醇磷酸重复单元组成的阴离子聚合物。它们分为两类：与肽聚糖分子共价连接的壁磷壁酸和与糖脂部分锚定在细胞质膜上的脂磷壁酸。在某些细菌种类中，壁磷壁酸可能占细胞壁总干重的一半。

最常见的壁磷壁酸结构是聚甘油磷酸[poly（Gro-P）]或聚核糖磷酸[poly（Rbo-P）]链。它们通过通常由双糖、N-乙酰甘露糖胺基-β（1-4）-N-乙酰葡萄糖胺和Gro-P单元组成的连接单元，通过磷酸二酯键与MurNAc的C6羟基共价连接到肽聚糖。典型的脂磷壁酸结构由一个与糖脂锚定相连的聚（Gro-P）链组成。Gro-或Rbo-醛糖醇单元上的游离羟基部分用D-Ala或单糖修饰，例如Glc、Gal或GlcNAc。聚（Gro-P）或聚（Rbo-P）链的长度因物种和菌株而异，取代水平也不同。在大多数革兰氏阳性细菌中，脂磷壁酸和壁磷壁酸共存，但某些细菌种类，包括干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，似乎只含有脂磷壁酸。值得注意的是，在植物乳杆菌中（取决于菌株），发现了两种类型的壁磷壁酸——具有聚（Gro-P）或聚（Rbo-P）链——此外，某些菌株含有合成这两种壁磷壁酸所需的基因。在一个植物乳杆菌突变体中，Gro-P型壁磷壁酸合成被取消，一个替代的病毒醇型壁磷壁酸被合成，而不是野生型Gro-P型壁磷壁酸。通过NMR分析从鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌中纯化的脂磷壁酸；发现它们具有聚（Gro-P）主链，平均含有50和22个Gro-P重复单元（分别针对每个物种），其中D-Ala是唯一可检测的取代基（分别为74%和42%D-Ala/GroP）。乳酸具有带有D-Ala和Gal取代基的聚（Gro-P）脂磷壁酸。

壁磷壁酸和脂磷壁酸具有聚磷酸甘油酯链结构的壁磷壁酸和脂磷壁酸。壁磷壁酸通过通常由双糖和磷酸甘油单元组成的连接单元通过磷酸二酯键与MurNAc的C6羟基共价结合到肽聚糖。脂磷壁酸通过糖脂锚定在细胞质膜上，糖脂是二葡萄糖基二酰甘油。R-表示甘油磷酸链上的取代基（如D-Ala、Glc、Gal或GlcNAc）。

磷壁酸的生物合成及其与肽聚糖的结合,根据醛糖醇成分的性质，生物合成酶被命名为Tag（含Gro的壁磷壁酸）或Tar（含Rbo的壁磷壁酸）。我们在这里介绍了含Gro的壁磷壁酸的合成，这主要是针对枯草杆菌描述的；然而，对于金黄色葡萄球菌中含有Rbo的壁磷壁酸发现了类似的生物合成方案。第一步由TagO在膜的细胞质表面开始，TagO是一种将GlcNAc-1-P从UDP-GlcNAc转移到十一烯醇磷酸酯的酶，十一烯醇磷酸酯也是参与肽聚糖合成的脂质载体。然后，乙酰甘露糖胺（ManNAc）通过TagA从UDP-ManNAc转移。以UDP-GlcNAc为原料，经MnaA差向异构化合成UDP-ManNAc。当TagB primase依次连接一个取自CDP甘油的Gro-P单元时，连接单元的合成完成。CDP甘油是由CTP和甘油经TagD反应生成的。用TagF催化壁磷壁酸聚合，将从CDP甘油中提取的Gro-P加到新生的壁磷壁酸链中。可连续添加多达60个醛糖醇磷酸基团。细胞内步骤完成后，壁磷壁酸链被ABC转运体TagGH转移到膜的细胞外侧；随后，该链与MurNAc的C6-OH上的肽聚糖-共价连接。枯草芽孢杆菌中鉴定出三种转移酶（TagTUV），它们属于LytR-CpsA-Psr（LCP）家族，参与了巴托普利连接的新合成壁磷壁酸向肽聚糖的转移。实验室中也发现了类似的酶，如乳酸杆菌，但它们的作用还有待研究。

脂磷壁酸的生物合成及其在细胞质膜中的锚定作用

脂磷壁酸通过插入细胞膜外层的糖脂与细菌细胞相连。这种糖脂是一种二葡萄糖基二酰甘油，由二酰甘油通过YpfP连续添加来自UDP-Glc的两种Glc合成。脂磷壁酸A然后将二葡萄糖基二酰甘油从膜的内侧转移到膜的外侧。脂质锚定的二葡萄糖基部分一旦离开膜，就会通过聚合过程被脂磷壁酸拉长，在大多数物种中，聚合过程会增加Gro-1-P单元；由此产生的脂磷壁酸链可以包含多达50个这样的单元。在某些物种中，第一个单位是由一种特殊的脂磷壁酸初级酶（脂磷壁酸P）加入的，脂磷壁酸P的作用是引发伸长。Gro-P的供体是磷脂酰二酰甘油分子。释放出来的二酰甘油可以循环利用，合成另一种脂磷壁酸分子。

磷壁酸的改性，壁磷壁酸和脂磷壁酸的糖醇磷酸链的游离羟基可被不同的糖（例如，Glc、Gal或GlcNAc）或D-Ala取代。在枯草杆菌中，一种名为TagE的糖基转移酶将Glc添加到壁磷壁酸中。D-丙氨酸化过程是最具特征性的，涉及d脂磷壁酸BCD操纵子。第一步是消耗ATP的D-Ala的活化和D脂磷壁酸对DltC载体的丙氨酸化。已经为涉及DltB和DltD的下一步提出了两个模型。在第一个模型中，DltB将D-Ala从DltC转移到十一烯醇磷脂（C55-P），然后翻转到膜外。DltD随后参与D-Ala向脂磷壁酸的转移。在第二个模型中，DltD更愿意通过促进D-Ala向DltC的转移在细胞质中发挥作用。DltC-Ala然后被DltB蛋白通过膜转运。DltC将是D-Ala向脂磷壁酸转移所需的唯一蛋白质。最近的数据证实了第一个模型，尽管到目前为止还没有检测到脂链中间体。D-Ala残基似乎可以沿着一条醛糖醇磷酸链自由移动，或者在不同的链之间自由移动，这使得壁磷壁酸的D-丙氨酸化成为可能。D-丙氨酰取代基可以通过提供质子化的氨基来调节磷壁酸的净负电荷，作为负电荷磷酸基团的反离子。这些修改在很大程度上有助于TA功能。

一个dlt操纵子已经在不同的实验室中被鉴定出来。在植物乳杆菌中，dlt操纵子包含两个补充基因pbpX2和dltX，分别编码一种蛋白质，其序列与具有D，D-羧肽酶活性的低分子量PBP的序列相似，以及一种长度为49个氨基酸的小蛋白质，其功能未知。当dlt操纵子失活时，磷壁酸上的D-Ala取代基完全缺失或数量显著减少，这一结果已在乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌中观察到。出乎意料的是，植物乳杆菌NCIMB8826 dltB突变体中D-Ala缺失的脂磷壁酸含有高水平的Glc亚基，而野生型脂磷壁酸中没有这种亚基，并且比野生型脂磷壁酸长三倍。此外，在鼠李糖乳杆菌GG中，与野生型脂磷壁酸相比，从dltD突变体中提取的脂磷壁酸显示糖脂锚定的脂肪酸链更长，Gro-P链更短。

磷壁酸的功能

壁磷壁酸和脂磷壁酸对细胞壁功能有显著贡献。磷壁酸的各种作用至少在一定程度上与它们的阴离子性质或它们在细菌细胞壁中的分布有关。D-Ala取代基的水平改变了磷壁酸的整体和局部电荷，对其功能也有重大影响。总的来说，磷壁酸提供了一个靠近细胞壁的离子库，这可能是酶正常工作所必需的。由于其阴离子性质，它们可以结合阳离子，如Mg2+和质子，从而在细胞壁上形成pH梯度。它们还发挥其他作用：控制自溶蛋白，维持细菌细胞形态，识别噬菌体，与宿主免疫系统相互作用，参与宿主定殖。下面详细介绍这些角色。在乳酸乳杆菌中，脂磷壁酸 D-丙氨酸化也对蛋白质分泌效率、抗紫外线胁迫和抗阳离子抗菌肽产生影响。

在某些革兰氏阳性细菌中，磷壁酸及其取代基长期以来被认为在细菌自溶的控制中起作用；它们被认为是通过几种机制起作用的。脂磷壁酸最初被认为是自溶蛋白抑制剂。通过测定阳离子自溶素结合位点的数量，也有人认为它们的D-丙氨酸化程度是调节自溶的一种手段。最后，壁磷壁酸/脂磷壁酸已被证明可以阻止自溶素与细菌表面的结合，但与细胞隔的结合除外，在细胞隔中这些分子可能不存在。

在实验室中，乳酸乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌dlt突变体的自溶速率比野生型菌株快，这是主要自溶素AcmA、Acm2和Msp1活性的结果。在乳酸乳杆菌中，这种表型与细胞壁内务蛋白酶HtrA对AcmA的降解降低有关。

磷壁酸在细菌细胞形态发生中产生作用。长期以来，壁磷壁酸被认为是重要的分子，因为壁磷壁酸生物合成途径相关基因的缺失在枯草杆菌中是致命的。然而，最近的报告表明，突变的致死效应是由于有毒中间产物的积累或十一烯醇磷酸载体的隔离，这也是合成肽聚糖所必需的。这一论点得到了以下事实的支持：枯草杆菌和金黄色葡萄球菌分别通过灭活tagO和tarO基因获得了缺乏壁磷壁酸的活突变体；它们各自编码生物合成途径的第一种酶。因此，壁磷壁酸在枯草杆菌中不再被认为是必需的，尽管它们的缺失严重改变了细胞形态和生长。已经在枯草杆菌中研究了磷壁酸在细胞分裂和形态发生中的作用，似乎壁磷壁酸参与细菌的伸长，而脂磷壁酸参与细胞分裂。同时缺乏壁磷壁酸和脂磷壁酸对枯草杆菌是致命的，这表明阴离子聚合物是革兰氏阳性细胞壁的必要组成部分。在金黄色葡萄球菌中，壁磷壁酸被描述为肽聚糖交联的时间和空间调节因子。

在植物乳杆菌中，一个tagO缺失突变体表明，虽然壁磷壁酸不是生存所必需的，但它们是细胞适当伸长和细胞分裂所必需的。原子力显微镜（AFM）对细菌细胞表面的成像结合凝集素探针的荧光标记显示，壁磷壁酸在细胞表面呈极化分布，在细胞两极不存在。此外，壁磷壁酸的极化分布似乎在控制细胞形态发生（表面粗糙度、细胞形状以及延伸和分裂）方面起着关键作用。此外，在植物乳杆菌中，脂磷壁酸的D-丙氨酸化在细胞形态中起着重要作用：在dltD突变体中观察到的较长的细菌细胞表明其伸长过程被改变。

脂磷壁酸作为噬菌体受体,脂磷壁酸已被证明是感染德氏乳杆菌亚种的LL-H噬菌体的受体成分。乳酸菌ATCC15808。此外，D-Ala和α-Glc取代基的聚（Gro-P）脂磷壁酸骨干影响噬菌体吸附。高度的D-丙氨酸化降低了吸附，而Glc取代基是有效结合所必需的，这表明这些脂磷壁酸结构修饰影响噬菌体尾部的抗受体蛋白与脂磷壁酸结合的程度。

脂磷壁酸在细菌-宿主串扰中起作用。脂磷壁酸似乎在宿主乳酸杆菌的相互作用中起着重要作用。首先，据报道，脂磷壁酸可能通过疏水相互作用，在约氏乳杆菌La1与人肠上皮细胞（Caco-2）的粘附中起主要作用。此外，TA D-Ala缺失可导致罗伊氏乳杆菌对小鼠胃肠道的定植受损。此外，脂磷壁酸是与Toll样受体2（TLR2）结合的微生物相关分子模式，Toll样受体2是一种存在于上皮细胞和抗原呈递细胞表面的PRR，在受到刺激后可激活细胞因子释放。据报道，从干酪乳杆菌YIT 9029和发酵乳杆菌YIT 0159中纯化的脂磷壁酸通过TLR2介导的菌株依赖机制显著诱导小鼠巨噬细胞分泌TNF-α。植物乳杆菌NCIMB8826的dlt突变体——其脂磷壁酸 D-丙氨酸基化显著降低——表现出抗炎特性，这与亲本菌株所证明的特性形成对比。与野生型相比，突变体外周血单核细胞源性细胞（PBMC）分泌促炎细胞因子（如TNFα和IL12）的数量显著减少，同时IL10的分泌也增加。此外，在三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的小鼠结肠炎模型中，dlt突变体具有抗炎作用。这些结果通过高纯度脂磷壁酸得到证实，脂磷壁酸刺激TLR2依赖性促炎细胞因子的产生。相反，在体外研究中，鼠李糖乳杆菌GG dltD突变体（其脂磷壁酸缺乏D-丙氨酰酯）未显示出显著的细胞因子产生变化；然而，在小鼠模型中，它与中重度DSS诱导的结肠炎中某些结肠炎参数的改善有关。此外，在缺乏脂磷壁酸的嗜酸乳杆菌脂磷壁酸突变体中，骨髓来源的树突状细胞（dc）中IL12和TNF-α的分泌被下调，而IL10的分泌和dc表面共刺激分子的表达被显著增强。当用脂磷壁酸突变体治疗DSS建立的结肠炎小鼠时，由于IL10和CD4+FoxP3+T调节细胞参与的机制，他们的状况得到改善。