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蛋白质组学研究概述

已有 1440 次阅读 2020-2-24 22:19 |个人分类:生物信息|系统分类:科研笔记

作者简介:中科院遗传与发育生物学研究所中丹学院博士生张泽宇,外号 “大神”,口号 “Now you see me”。


这是其刚入学时做的一个报告。


本篇介绍下蛋白质组学,如果覆盖度深的话,应该是新时代的宠儿了。


古希腊,一个神一样的存在,不只有雅典娜,更孕育了“ome”等一批高大上的词汇。组学表示一组物质整体的表现。蛋白质组学表示特定系统内蛋白质集合的研究。


蛋白质组学有基于二维凝胶分离 (2D-Gel)和质谱鉴定技术。


2D-Gel根据蛋白的等电点和分子质量的差异,通过等点聚焦和SDS-PAGE分离,通过染色和成像把不同电性和大小的蛋白质显示在凝胶上。



点的密度、大小、位置不同可以定性查看有无和相对定量地查看丰度差异。



chromatography 层析、色谱,(graphy也来源于希腊文,意为写)。携带样品的流动相穿过固定相时,由于样品各组分理化性质存在差异,与固定相作用力弱的组分,移动速度快;反之,移动速度慢。根据不同的保留时间,收集特定属性的样品进行进一步分析。根据流动相的不同又分为气相色谱和液相色谱。



高效液相色谱,又称为高压液相色谱,高速液相色谱。流动相为液体,在高压作用下快速流过固定相,分离效能高,灵敏度高,应用范围广,柱子可反复使用。最早洗脱出的是越亲水的。



质谱是测量离子质荷比的分析方法,基本原理是使待测样品中的组分在离子源中离子化,经过电场加速形成离子束,进入质量分析器,获得质谱图。与Uniprot数据库比较,得到对应的蛋白定量。



常用离子源有:基质辅助激光解吸电离(MALDI);电喷雾电离(ESI)。



飞行时间质谱 (TOF),分析物的质荷比是根据分析物在真空飞行管中的飞行时间推算出的。飞行时间质谱的质量分析器由调制区、加速区、无场飞行空间和检测器等部分组成。样品分子电离以后,将离子加速并通过一个无场区,不同质量的离子具有不同的能量,通过无场区的飞行时间长短不同,可以依次被收集检测出来。

四极杆 (Quadrupole,Q)质谱仪,从单级四极杆到三级四极杆, 功能越来越强。第一级四极杆选母离子,第二级四极杆作为碰撞室对母离子进行碰撞解离,第三级四极杆作为质量分析器完成离子分析。三级四极杆采集到的MS/MS质谱图信息量大,并且较少发生重排反应,因而四极杆的质谱数据质量要高于离子阱串联质谱数据。

离子阱 (Orbitrap)质谱仪,串联质谱仪,在分析前先将离子聚集储存,离子阱是该仪器的核心部分,既可以作为碰撞室,又可以作为质量分析器。分为线性离子阱和三维离子阱。线性离子阱具有更大的离子容量和扫描速度。



蛋白质组实验流程文字和图形总结



定性蛋白质组学


从样品中分析全蛋白,胰蛋白酶消化成多肽,经液相色谱-质谱检测,比较实际检测到的质荷比和理论预测的质荷比,鉴定蛋白的种类。



离子的属性和质量不同会产生不同的质量指纹图谱。


若多肽的氨基酸组成一样,但顺序不同,如何区分?


串联质谱,先获得小肽的质量;再将肽离子诱导碰撞碎裂成更小的碎片离子,获得二级质谱图谱。



不同的片段化方式会得到不同的片段







MASCOT软件搜库鉴定蛋白



鉴定蛋白翻译后修饰



磷酸化肽段富集 (类比于ChIP中的富集和Input)





定量蛋白质组学



Label free相对定量,蛋白的量与Peak强度正相关。



酶解标记法, 酶解时加入H218O,可以在肽段C端加2个重氧原子。



iTRAQ 技术采用4种或8种同位素编码的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,而后进行串联质谱分析,可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。



SILAC: 两组细胞同时培养,A组是在包含正常氨基酸(light)的培养基中;B组的培养基则含有“重型(heavy)”的氨基酸,即稳定同位素标记的氨基酸。最初SILAC使用的标记氨基酸是氚代甲硫氨酸和氘代甘氨酸,目前常用的标记氨基酸有亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸等。细胞传代若干代后,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到蛋白中,取代了原有的氨基酸。这样,两个蛋白之间就存在分子量的改变,而其它化学性质无异。





现存技术的缺点



靶向蛋白质组技术主要包括SRM/MRM和PRM两种方法。SRM/MRM (Selected/ Multiple reaction monitoring)使用的是三重四级杆的质谱,利用四级杆高选择性的特点对母离子和子离子依次进行分选。

PRM(Parallel reaction monitoring)技术,该技术结合了四级杆的高选择性以及Orbitrap的高分辨、高精度特性,能够对二级图谱进行独立的鉴定,方法流程更加便捷。与传统的SRM/MRM相比,PRM在复杂背景下具有更优秀的抗干扰能力和检测灵敏度。





同源搜索或结合转录组数据解决注释缺失的问题




总结



Ref:

  1. 360doc.com/content/15/0

  2. tech.sina.com.cn/roll/2

  3. thermofisher.com/cn/zh/

  4. baike.baidu.com/item/%E




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1 杨卫东

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