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单细胞分析Seurat使用相关的10个问题答疑精选!

已有 6792 次阅读 2020-2-24 22:04 |个人分类:生物信息|系统分类:科研笔记

NGS系列文章包括NGS基础、转录组分析 (Nature重磅综述|关于RNA-seq你想知道的全在这)、ChIP-seq分析 (ChIP-seq基本分析流程)、单细胞测序分析 (重磅综述:三万字长文读懂单细胞RNA测序分析的最佳实践教程 (原理、代码和评述))、GEO数据挖掘(典型医学设计实验GEO数据分析 (step-by-step) - Limma差异分析、火山图、功能富集)等内容。


作为一个刚刚开始进行单细胞转录组分析的菜鸟,R语言底子没有,有时候除了会copy外,如果你让我写个for循环,我只能cross my fingers。。。。

于是我看见了https://satijalab.org/seurat/,Seurat是一个R软件包,设计用于QC、分析和探索单细胞RNA-seq数据。Seurat旨在帮助用户能够识别和解释单细胞转录组学中的的异质性来源,并通过整合各种类型的单细胞数据,能够在单个细胞层面上进行系统分析。

里面非常详细的介绍了这个单细胞转录组测序的workflow,包括添加了很多的其他功能,如细胞周期 (Seurat亮点之细胞周期评分和回归)等。

但里面有蛮多的代码的原理其实我并不太清楚 (读完这个,还不懂,来找我,重磅综述:三万字长文读懂单细胞RNA测序分析的最佳实践教程 (原理、代码和评述)),这次我就介绍一下里面让我曾经困惑的几个问题以及比较nice的解答!(令我万万没想到,找答案比自己写答案确实困难的多。。。)

1. 有关merge函数的问题



merge只是放在一起,fastMNN才是真正的整合分析。

2. 有关PC的选择



  1. Seurat应用JackStraw随机抽样构建一个特征基因与主成分相关性值的背景分布,选择富集特征基因相关性显著的主成分用于后续分析。对大的数据集,这一步计算会比较慢,有时也可能不会找到合适的临界点。

  2. 建议通过ElbowPlot来选,找到拐点或使得所选PC包含足够大的variation了 (80%以上),便合适。然后再可以在这个数目上下都选几个值试试,最好测试的时候往下游测试些,越下游越好,看看对结果是否有影响。

  3. 另外一个方式可以是根据与各个主成分相关的基因的GSEA功能富集分析选择合适的主成分 (一文掌握GSEA,超详细教程)。

  4. 一般选择7-12都合适。实际分析时,可以尝试选择不同的值如1015或所有主成分,结果通常差别不大。但如果选择的主成分比较少如5等,结果可能会有一些变化。

  5. 另外要注意:用了这么多年的PCA可视化竟然是错的!!!

3. 细胞周期相关基因


Pairs of genes (A, B) are identified from a training data set where in each pair, the fraction of cells in phase G1 with expression of A > B (based on expression values in training.data) and the fraction with B > A in each other phase exceeds fraction. These pairs are defined as the marker pairs for G1. This is repeated for each phase to obtain a separate marker pair set.

4. Seurat对象导入Monocle



其实这个问题我也遇到了,并且已经有人给出了解决方案。(生信宝典注:官方最开始没支持Seurat3,我写了个简易的,在github.com/cole-trapnel,现在应该更新全面支持Seurat3了。)

seurat_data <- newimport(SeuratObject)

###重新定义了import函数,称为newimport
newimport <- function(otherCDS, import_all = FALSE) {
  if(class(otherCDS)[1] == 'Seurat') {
    requireNamespace("Seurat")
    data <- otherCDS@assays$RNA@counts

    if(class(data) == "data.frame") {
      data <- as(as.matrix(data), "sparseMatrix")
    }

    pd <- tryCatch( {
      pd <- new("AnnotatedDataFrame", data = otherCDS@meta.data)
      pd
    },
    #warning = function(w) { },
    error = function(e) {
      pData <- data.frame(cell_id = colnames(data), row.names = colnames(data))
      pd <- new("AnnotatedDataFrame", data = pData)

      message("This Seurat object doesn't provide any meta data");
      pd
    })

    # remove filtered cells from Seurat
    if(length(setdiff(colnames(data), rownames(pd))) > 0) {
      data <- data[, rownames(pd)]
    }

    fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))
    fd <- new("AnnotatedDataFrame", data = fData)
    lowerDetectionLimit <- 0

    if(all(data == floor(data))) {
      expressionFamily <- negbinomial.size()
    } else if(any(data < 0)){
      expressionFamily <- uninormal()
    } else {
      expressionFamily <- tobit()
    }

    valid_data <- data[, row.names(pd)]

    monocle_cds <- newCellDataSet(data,
                                  phenoData = pd,
                                  featureData = fd,
                                  lowerDetectionLimit=lowerDetectionLimit,
                                  expressionFamily=expressionFamily)

    if(import_all) {
      if("Monocle" %in% names(otherCDS@misc)) {
        otherCDS@misc$Monocle@auxClusteringData$seurat <- NULL
        otherCDS@misc$Monocle@auxClusteringData$scran <- NULL

        monocle_cds <- otherCDS@misc$Monocle
        mist_list <- otherCDS

      } else {
        # mist_list <- list(ident = ident)
        mist_list <- otherCDS
      }
    } else {
      mist_list <- list()
    }

    if(1==1) {
      var.genes <- setOrderingFilter(monocle_cds, otherCDS@assays$RNA@var.features)

    }
    monocle_cds@auxClusteringData$seurat <- mist_list

  } else if (class(otherCDS)[1] == 'SCESet') {
    requireNamespace("scater")

    message('Converting the exprs data in log scale back to original scale ...')
    data <- 2^otherCDS@assayData$exprs - otherCDS@logExprsOffset

    fd <- otherCDS@featureData
    pd <- otherCDS@phenoData
    experimentData = otherCDS@experimentData
    if("is.expr" %in% slotNames(otherCDS))
      lowerDetectionLimit <- otherCDS@is.expr
    else
      lowerDetectionLimit <- 1

    if(all(data == floor(data))) {
      expressionFamily <- negbinomial.size()
    } else if(any(data < 0)){
      expressionFamily <- uninormal()
    } else {
      expressionFamily <- tobit()
    }

    if(import_all) {
      # mist_list <- list(iotherCDS@sc3,
      #                   otherCDS@reducedDimension)
      mist_list <- otherCDS

    } else {
      mist_list <- list()
    }

    monocle_cds <- newCellDataSet(data,
                                  phenoData = pd,
                                  featureData = fd,
                                  lowerDetectionLimit=lowerDetectionLimit,
                                  expressionFamily=expressionFamily)
    # monocle_cds@auxClusteringData$sc3 <- otherCDS@sc3
    # monocle_cds@auxOrderingData$scran <- mist_list

    monocle_cds@auxOrderingData$scran <- mist_list

  } else {
    stop('the object type you want to export to is not supported yet')
  }

  return(monocle_cds)
}

5. 不同条件下画热图



6. Seurat对象转化为.h5ad对象



Answer:Looks like the way to do it is to write to loom format via loomR(github.com/mojaveazure/), then read that into anndata (anndata.readthedocs.io/) to be written as an .h5ad file.

Single cell folks need to a pick a file format/structure and stick with it.

生信宝典注:不同文件类型和格式之间的转换确实是一个问题,好在易生信提供了好的解决方案。来这试试?易生信线下课推迟,线上课程免费看

7. 根据基因取细胞子集



也可以提取特定Cluster,进行进一步细分。

# 提取特定cluster,继续后续分析。
ident_df <- data.frame(cell=names(Idents(pbmc)), cluster=Idents(pbmc))
pbmc_subcluster <- subset(pbmc, cells=as.vector(ident_df[ident_df$cluster=="Naive CD4 T",1]))

8. 筛选条件的设置



这是最开始读入的初始设置,后面质控还有更多筛选方式。

质控是用于保证下游分析时数据质量足够好。由于不能先验地确定什么是足够好的数据质量,所以只能基于下游分析结果(例如,细胞簇注释)来对其进行判断。因此,在分析数据时可能需要反复调整参数进行质量控制 (生信宝典注:反复分析,多次分析,是做生信的基本要求。这也是为啥需要上易生信培训班而不是单纯依赖公司的分析。)。从宽松的QC阈值开始并研究这些阈值的影响,然后再执行更严格的QC,通常是有益的。这种方法对于细胞种类混杂的数据集特别有用,在这些数据集中,特定细胞类型或特定细胞状态可能会被误解为低质量的异常细胞。在低质量数据集中,可能需要严格的质量控制阈值。具体见:

陷阱和建议
  • 通过可视化检测到的基因数量、总分子数和线粒体基因的表达比例的分布中的异常峰来执行QC。
    联合考虑这3个变量,而不是单独考虑一个变量。

  • 尽可能设置宽松的QC阈值;
    如果下游聚类无法解释时再重新设定严格的QC阈值。

  • 如果样品之间的QC变量分布不同(存在多个强峰),则需要考虑样品质量差异,应按照Plasschaert et al. (2018)的方法为每个样品分别确定QC阈值。


9. RunTSNE不是在聚类


区分好聚类 (FindClusters)和降维 (PCAtSNEUMAP)。

10. Seurat与线粒体基因


这是一个简单的操作问题,读懂代码就好解决了。送您一句话:Some years back when I was less experienced not being sure if I did an analysis right used to keep me up at night … I am still not sure if I do it right now but I sleep better ;-)





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1 郭子毅

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