最近中国中医科学院研究员屠呦呦先生因为发现抗疟疾药物青蒿素喜获2015年度诺贝尔生理或医学奖，“青蒿素”迅速引起社会的广泛关注。青蒿素是一种萜类化合物，于上世纪70年代被发现，最初是从植物黄花蒿提取而来，现在国内主要生产方法依然是从黄花蒿提取，但是植物提取存在占用耕地、依赖环境气候、提取过程繁琐等问题。全世界每年有几亿人左右感染疟疾（2010年感染人数高达2亿，死亡数高达655000人），解决青蒿素的生产原料问题，经济社会意义重大。

      近些年随着合成生物技术、代谢工程技术、基因合成技术等快速发展，人类改造微生物的能力迅猛提高，为重要化学品的微生物合成技术开发提供了坚实基础。在青蒿素的微生物合成上率先取得重大进展的是美国加州大学伯克利分校教授Jay Keasling。2004年，在盖茨基金会赞助下，Keasling教授和生物技术公司Amyris合作启动了“青蒿素项目”。

  项目初期，Keasling等尝试在大肠杆菌中完成青蒿素的前体-青蒿酸的微生物合成[1]，这是由于大肠杆菌的遗传信息丰富、基因操作技术成熟，在当时是最为成熟的模式微生物之一（图1）。早在2003年，Keasling教授课题组就在Nature Biotechnology发表文章，介绍在大肠杆菌中合成青蒿酸的另外一个前体物-青蒿二烯的工作[2] （可能因为这篇论文被盖茨基金会选中作为青蒿素攻关的实施者）。通过异源表达酿酒酵母来源的甲羟戊酸途径（MVA pathway）克服了大肠杆菌中萜类前体物合成的技术障碍（图2）。在大肠杆菌内源性萜类前体物合成途径（DXP pathway）的潜能挖掘上，美国麻省理工学院Stephanopoulos教授课题组取得重要突破[3]。通过尝试不同物种来源的关键基因HMGS和HMGR，对途径中基因表达量进行优化，结合发酵过程优化，青蒿二烯的产量达到27g/L[4]。但是在进行青蒿二烯向青蒿酸的这步转化中，项目组碰到是一个难题。这步转化是由P450氧化酶CYP71AV1催化，是一步氧化反应。P450氧化酶在大肠杆菌中一直以来都不能高效表达，表达CYP71AV1的重组大肠杆菌只能生产1g/L的青蒿酸，即转化率只有4%左右。无奈之下，项目组对项目的技术路线进行调整，尝试用酿酒酵母生产青蒿酸。

图1  青蒿素项目技术路线示意图[5]

图2  在大肠杆菌中合成青蒿二烯的代谢途径[2]

 

与原核生物大肠杆菌不同，酵母是真核生物，能够较好表达P450酶。在2006年，Keasling等通过对酵母中的MVA途径代谢调控关系的调整、关键基因表达量优化、前体物FPP代谢支路的削弱，结合氧化酶CYP71AV1的表达，成功构建产青蒿酸的酵母菌株，产量达到115mg/L，通过发酵优化青蒿酸的产量可以进一步提高到2.5g/L[6]（图3）。该项研究成果在国际上产生重大影响，被《Discovery》杂志评为当年的十大科学进展之一。在以后的几年中，Keasling课题组和Amyris的科研人员合作对酵母合成体系进行了一系列优化，包括更换表达菌株、强化HMGR基因表达、敲除半乳糖代谢基因等遗传修饰，同时对发酵过程进行优化，例如碳源、氮源、磷酸盐含量等，使青蒿二烯的产量达到40g/L [7]。在该研究的基础上，科研人员重点攻克青蒿二烯向青蒿酸转化的技术难题。通过进一步的基因挖掘，他们找到了与转化相关的另外三个基因：细胞色素b5基因、青蒿醇脱氢酶基因、青蒿醛脱氢酶基因。在合成青蒿二烯酵母菌株中表达这三个基因，同时优化CYP71AV1辅助还原酶CPR1的表达量和发酵过程，青蒿酸产量提高到25g/L，青蒿素项目取得重大突破和成功[8]（图4）。另外，科研人员还开发了从青蒿酸到青蒿素的化学合成方法，包括加氢还原、酯化、氧化、Hock裂解和重排四步反应，整个转化过程的收率在40-45%，相关的科研成果发表在2013年4月25日的《Nature》杂志上。至此，科学人员耗时十年完成了青蒿素的半合成工艺（微生物合成加化学合成）。

图3  改造酵母菌合成青蒿酸的技术示意图[6]

图4  在酿酒酵母中合成青蒿酸的技术路线图[8] 

2013年5月，世界卫生组织批准微生物合成的青蒿素作为临床药物使用，说明微生物合成技术生产的青蒿素的安全性和有效性与传统植物提取法生产的青蒿素相同，相信以后越来越多的疟疾患者尤其是非洲地区的患者会使用微生物生产的廉价青蒿素药物。这种半合成青蒿素的工艺技术在未来若干年肯定会取代传统植物提取技术。2013年4月，法国制药业巨头Sanofi宣布开始应用Amyris开发的青蒿素生产工艺工业化生产青蒿素。我国的青蒿素传统生产企业如昆药集团、复兴医药等面临的市场竞争压力巨大。

作为一种新型尖端技术，微生物合成技术的潜力巨大。它可以突破传统植物提取的局限，不受地理位置、土壤状况、自然气候环境、灾害的影响，理论上可以在任何有发酵罐的工厂全天候生产，产品质量稳定、生产周期短、生产效率高、生产成本低廉，产品更具市场竞争力，应用前景广阔。

尽管当前社会上对“转基因”技术尤其是转基因食品存在一定的恐慌和偏见，相信随着科学普及工作的推广、信息交流的透明和深化、安全评审制度的建立和完善，微生物合成技术作为一种新的天然药物原料生产工艺在以后的药物生产领域会越来越普遍，前景越来越光明，相信微生物合成技术的黄金时代即将到来。

 

参考文献：

1. Paddon C J, Keasling J D.Semisynthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology inpharmaceutical development[J]. Nature Reviews Microbiology, 2014, 12(5):355-367.

2. Martin V J J, Pitera D J, Withers ST, et al. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for productionof terpenoids[J]. Nature biotechnology, 2003, 21(7): 796-802.

3. Ajikumar P K, Xiao W H, Tyo K E J, etal. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction inEscherichia coli[J]. Science, 2010, 330(6000): 70-74.

4. Tsuruta H, Paddon C J, Eng D, et al.High-level production of amorpha-4, 11-diene, a precursor of the antimalarialagent artemisinin, in Escherichia coli [J]. PLoS One, 2009, 4(2): e4489.

5. Hale V, Keasling J D, Renninger N, etal. Microbially derived artemisinin: a biotechnology solution to the globalproblem of access to affordable antimalarial drugs[J]. The American journal oftropical medicine and hygiene, 2007, 77(6 Suppl): 198-202.

6. Ro D K, Paradise E M, Ouellet M, etal. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid inengineered yeast[J]. Nature, 2006, 440(7086): 940-943.

7.Westfall P J, Pitera D J, Lenihan J R, et al. Production of amorphadiene inyeast, and its conversion to dihydroartemisinic acid, precursor to theantimalarial agent artemisinin[J]. Proceedings of the National Academy ofSciences, 2012, 109(3): E111-E118.

8.Paddon C J, Westfall P J, Pitera D J, et al. High level semisyntheticproduction of the potent antimalarial artemisinin[J]. Nature, 2013, 496(7446):528-532.

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