乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（Covalently closed circular DNA，cccDNA）作为HBV原始复制模板聚集在感染肝细胞核中形成cccDNA池，半衰期长，现有抗病毒药物不能清除，是宿主肝细胞持续感染和抗病毒治疗后产生耐受和停药后复发的关键。那么，如何清除慢性HBV感染者肝细胞核内的cccDNA，将是其根治的关键环节。

1  HBV急性感染的cccDNA清除途径

多数免疫功能正常的患者感染HBV后，可以通过细胞溶解途径和非细胞溶解途经来清除cccDNA，为自限性疾病。肝细胞感染HBV后，其toll样受体（TLRs）介导人白细胞抗原（HLA）家族1表达上调，释放α干扰素（IFN-α）和IFN-β等细胞因子。IFN-α/IFN-β通过激活双链依赖性蛋白激酶（PKR）来抑制HBV蛋白合成，并征募激活抗原呈递细胞（APC）、自然杀伤细胞（NK）、枯否细胞、树突状细胞（DC）、细胞毒性T淋巴细细胞（CTL）、CD4+和CD8+T细胞等。非细胞溶解途经为APC细胞、枯否细胞、DC细胞、CD8+T细胞、Th1 CD4+T细胞等分泌促炎症因子IFN-γ、肿瘤坏死因子-β（TNF-β）、白介素-2（IL-2）、IL-12、IL-18、趋化因子CCL3等形成炎症反应瀑布效应并启动获得性免疫反应。TNF-α和IFN-γ可通过NF-κB破坏病毒包膜、一氧化氮（NO）降解病毒蛋白及RNA等多种机制清除HBV[1]。细胞溶解途经为CTL、NK、CD8+T等细胞通过直接裂解感染肝细胞来清除cccDNA。Th2 CD4+T细胞可刺激B细胞产生HBs抗体、HBc抗体和HBe抗体形成体液免疫，并分泌炎症抑制因子如转化生子因子（TGF-β）、IL-4，IL-5和IL-10等来缓解炎症反应[2]。非细胞溶解途经为快速清除期，发生于HBV感染后前8周，可以清除约90%的cccDNA，在cccDNA清除中占主导地位；细胞溶解途经发生于感染8周后，为慢速清除期。

2  HBV慢性感染cccDNA持续存在的原因

约10%的成年人及90%的青少年免疫系统发育不全，HBV感染后可发生慢乙肝[3]。慢乙肝患者先天性免疫功能下降，肝细胞TLRs分泌减少，B细胞分泌IL-10过多，CD4+和 CD8+T细胞处于免疫耐受状态，不能识别并结合HBV特异性多肽片段发挥细胞毒性效应[4]。T-bet分泌抑制和GATA-3过度表达导致Th1/Th2反应失衡[5]，Treg细胞、Th2 CD4+T细胞等分泌的TGF-β1等炎症抑制因子过多，通过高表达细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P15和P21在G1阶段阻断NK细胞循环[6]、减少NKG2D/DAP10和2B4/SAP在NK细胞表面表达损伤其杀伤效应[7]；DC等细胞功能缺陷，释放IFN-γ等促炎症因子减少，无法形成炎症反应瀑布效应。HBV蛋白成分如HBx抗原可通过NF-κB等影响机体免疫反应和抗原呈递、促进TGF-β1分泌；HBe抗原通过Fas调节凋亡并耗竭HBe或HBc抗原特异性CD4+T细胞、减少单核细胞TLR2受体表达[8]。多种因素造成肝细胞内cccDNA持续存在而形成慢性感染。

3  慢性HBV感染的cccDNA清除策略

3.1  核苷（酸）类似物和IFN-α难以清除cccDNA

核苷（酸）类似物如拉米夫定（3-TC）、阿德福韦酯（ADV）等通过抑制前基因组RNA（Pregenomic RNA，pgRNA）逆转录来减少HBV DNA及其亚病毒的复制，并由于rcDNA再次进入肝细胞核减少而缓慢耗竭cccDNA池。Chong CL等发现和肝细胞有丝分裂起始期和停滞期相比在指数期使用3-TC，由于有丝分裂稀释作用可大幅降低肝细胞内cccDNA拷贝数[9]，因此核苷酸类似物联用炎症抑制剂或部分肝切除术有可能加强cccDNA清除效果。IFN-α是具有抗病毒和免疫调节功能的双重治疗功效细胞因子，可通过激活干扰素刺激性反应因子（ISRE）、下调结合在cccDNA微染色体上的STAT1和STAT2、征募去乙酰化酶YY1、Ezh2、HDAC1、hSirt1促进组蛋白去乙酰化来抑制cccDNA转录[10]。IFN-α还可通过持续征募HBV转录后管理因子（PRC2）辅抑制剂促进组蛋白去磷酸化和甲基化，从而具有抑制cccDNA转录延续效应[11]。核苷（酸）类似物和IFN-α均可以通过降低病毒载量来部分缓解患者免疫缺陷[7]，但由于药物副作用及长期用药HBV耐药性病毒株的出现，它们单用或联用完全清除cccDNA的效果欠佳。

3.2  RNA干扰技术的探索

RNA干扰技术是短小的干扰RNA（siRNA）通过序列特异性降解目的mRNA而起到调节RNA表达的作用。HBV核心蛋白磷酸化是mRNA逆转录的关键因素，其核苷酸保守信号区域（NLS）位于C末端145~156和172~183氨基酸，其功能对于rcDNA能够进入肝细胞核补充cccDNA池很重要。LI GQ等构建了包含针对HBV NLS区域的siRNA的Psi/U6质粒，将其转染入HepG2.2.15细胞后显著降低细胞核cccDNA水平[12]。为防止基因突变可能降低siRNA抗病毒的效果，Xin XM等建议选择HBV基因组保守基因区域作为siRNA序列的靶位点，并同时作用于多个位点[13]。PRE是RNA保守区域反式激活因子， 有500bp长（nt1151-1684），参与管理mRNA逆转录、裂解和核酸转移等。Panjaworayan N等构建了针对HBV PRE的siRNA，为防止目的DNA和人类基因序列重合率过高（>85%），选择nt1317-1337和nt1329-1349作为siRNA作用目标。结果显示作用于nt1317-1337的低剂量（60ng）siRNA质粒即可显著降低转染HBV的HepG2细胞核的cccDNA水平，而作用于nt1329-1349的siRNA质粒无此效果。分析认为HBV PRE 1317-1337参与所有HBV病毒和亚病毒的转录，siRNA对其沉默作用自然会导致cccDNA合成减少[14]。

3.3  锌指蛋白的治疗尝试

ZFP（Zinc finger protein，ZFP）是含有通过结合Zn2+稳定的短的可以自我折叠形成“手指”结构的一类Cys2His2 DNA结合蛋白质，由于其自身结构特点，可以选择性的结合特异的DNA靶序列，在基因的表达调控中发挥重要作用。ZFP 可直接结合cccDNA启动子阻碍其转录，并且肝脏的免疫耐受性决定了ZFP治疗策略可能不会引起机体免疫排斥反应。Zimmerman KA等设计了锚定鸭乙型肝炎病毒（DHBV）cccDNA微染色体内控制核心和表面启动子的6个ZFP，主要结合转录因子HNF1、HNF3和CCAAT/启动子结合蛋白β（C/EBPβ）等。ZFP转导入转染DHBV的LMH细胞后，凝胶迁移滞后试验（EMSA）和表面等离子共振技术（SPR）检测锚定动力学显示和空载体控制组相比，ZFP转染后DHBV RNA、核心及表面蛋白及子代病毒合成显著抑制，并没有明显的细胞毒性[15] 。ZFP的传送可以采用基因治疗（如复制不完全腺病毒）或一些不同蛋白传送模式，如脂质体、纳米粒子、合成聚合物等。锌指核酸（Zinc-finger Nucleases，ZFN）包含可串联ZFP结构域的Ⅱ型限制性内切酶，在两端ZFP结合目的基因后，可以“序列特殊性劈开”方式切开中间DNA。Cradick TJ等研究显示，HBV特异性ZFN在转染了pTHBV2的Huh7细胞内可将cccDNA裂解为线型DNA和“尾对尾”串联型DNA从而失去复制能力，即使线型DNA又形成环型DNA也可以再次成为ZFN作用目标[16]。Mao R等研究认为，人锌指蛋白（hZFP）属于宿主固有免疫系统一部分，通过包含4个串联CCCH型锌指结构域的蛋白N-末端转录后降解HBV RNA来参与机体免疫反应[17]。

3.4  获得性T细胞治疗的效应

微弱和单克隆T细胞反应是慢乙肝发病原因之一。获得性T细胞治疗是通过将可识别HBV包膜蛋白的嵌合T细胞受体（cTCR）导入T细胞，通过NF-κB系统识别肝细胞表面HBsAg，并刺激IFN-γ、TNF-β等释放发挥T细胞免疫效应。BONHKE F等将转导了可识别大S蛋白（scFv 5a19）和小S蛋白（scFv C8）cTCR的T细胞与转染HBV的HepG2细胞共培养，可选择性溶解cccDNA阳性肝细胞而大幅度显著降低核内cccDNA和rcDNA水平。研究表明转导scFv C8 cTCR的T细胞效果（清除99%的cccDNA）高于转导scFv 5a19 cTCR的T细胞（清除80%的cccDNA），因为HBV包膜蛋白中83%到94%为小S蛋白，而大S蛋白仅占1%到2%[18] 。Krebs K等将含有可结合HBV包膜蛋白的单链抗体片段（scFv）的嵌合抗原受体（S-CAR）的MP71逆转录病毒载体的T细胞转导入HBV转基因小鼠，发现其血清IFN-γ、TNF-β、MCP-10、IL-6、IL-10等细胞因子水平、肝内单核细胞、DC细胞、中性粒细胞等数量显著高于转导CEA-CAR T细胞小鼠及空载体小鼠。HBV转基因小鼠转染S-CAR T细胞12天后其血清HBV DNA水平下降约100倍，肝内cccDNA水平清除效果尚无法观察因为其HBV复制不以cccDNA为模板[19]。该方案临床应用还需解决几个问题，包括如何将转导cTCR的T细胞精确传送至肝脏及严格区分感染和未感染HBV的肝细胞等。建议服用核苷类抗病毒治疗后应用该方案以减少肝细胞损伤，并提前注射IL-12上调抗凋亡机制、促进记忆细胞分化以提高疗效[20]。

3.5  DNA免疫治疗的前景

   和传统疫苗仅激活体液免疫不同，这种治疗是将转导重组抗原的质粒DNA注射入体内，激活体内MHCⅠ、MHCⅡ通路和CD4+、CD8+细胞反应从而同时激活体内细胞和体液免疫反应。通过增加免疫调节序列如CPG寡核苷酸、炎症因子基因如INF-γ共传递、设计截断DNA免疫、优化质粒DNA载体并改进载体传递等策略，还可提高其治疗效果[21]。Thermet A等将转导DHBV S区、C区、S+C区DNA的质粒，在实验第6周、第10周、第14周、第28周和第35周注射入转染了DHBV的北京幼鸭（3天）慢乙肝模型，结果发现以0.08拷贝/细胞为RT-PCR法检测cccDNA下限值，免疫单独或联合应用3-TC治疗肝内cccDNA检测阴性率（9/30）显著高于3-TC单独治疗组（0/12），并且治疗几周后未出现复发[22]。临床试验也显示DNA免疫治疗可激活慢乙肝患者特异性针对HBs抗原体液和细胞免疫[23] 。猪、羊等大型动物实验则发现，通过电穿孔来传递质粒DNA可在肌肉和皮肤增加约1000倍的基因表达从而提高免疫反应[24] 。

4  结  语

cccDNA持续存在是慢乙肝患者持续感染和复发的重要因素，已实现血清学HBsAg转换及病毒学反应的慢乙肝患者肝内仍可检测出微量cccDNA[25，26] 。根治慢乙肝的关键在于清除肝内cccDNA，但目前研究认为慢乙肝患者并不需要彻底清除肝内cccDNA，只要将其水平控制在机体免疫反应监控范围内即可，因为HBV DNA制造率（肝内HBV DNA水平/cccDNA水平）会随着肝内cccDNA水平的下降而下降[27] 。相信cccDNA检测方法、cccDNA清除策略及联合应用的改进会缩短抗病毒疗程、减少副作用及耐药型病毒株的出现，并最终实现根治慢乙肝的目标。

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