作为显微镜成像系统中最重要的元件，大多数单分子荧光显微镜中，物镜不仅用于收集荧光信号，还用于聚焦激发光的作用，因此物镜的质量很大程度上决定了整个系统的成像质量。显微镜的放大倍数、空间分辨率、收集效率等重要参数都主要由物镜的参数决定。通常从成像角度讲，物镜可以看成一个焦距非常小的透镜，但是为了得到更好的成像效果，现在商用物镜结构都比较复杂，通常由多个透镜组组成。但是对于简单估计和计算显微镜成像参数时，整个物镜可以作为单一的透镜来处理。比如显微镜的放大倍数可以简单的用成像透镜的焦距除以物镜焦距来计算。作为行业内一般标准，大部分商用透镜标记的放大倍数是以成像透镜焦距为160 mm为标准来计算的，因此通过透镜上标记的放大倍数读数可以计算物镜的焦距。

数值孔径（NA）是一个物镜的最重要参数，其定义为：

其中n是物镜工作介质的折射率（空气的折射率为1.0，水的折射率为1.33，油的折射率可以达到1.56），是光聚焦最大锥角的一半的正弦值如图2.2.1所示。

图2.2.1 物镜数值孔径

根据阿贝衍射极限，当平行光通过透镜聚焦时，光斑直径最小极限为1.22λ/NA，其中λ为光的波长。由于波长的选择受研究体系的限制，因此数值孔径的大小直接决定了显微镜的空间分辨率。数值孔径越大，显微镜分辨率越高。根据定义，要得到较大的数值孔径有三个途径：增大物镜的直径，缩短物镜焦距以及增大介质折射率。增大物镜直径和缩短焦距是两个对立的手段，由于目前加工技术限制，在保持焦距不变的情况下，物镜直径已接近极限。因此增大介质的折射率是目前非常流行的方法。空气的折射率大约为1，水的折射率为1.33，而玻璃的折射率为1.5左右，现在商用物镜很多采用特殊的油作为介质，称为油镜。所使用的油要么与基片玻璃的折射率相同，要么与物镜本身材料的折射率相同，从而消除不同折射率材料界面造成的光损失和光路偏差。图2.2.2通过对比透镜在空气中和油相几介质中的光路，展示二者收集效率的差别。在空气中，由于空气和染料分子所在的基片具有不同的折射率，因此荧光通过界面是会发生折射现象，当荧光通过界面都将变得更加发散，造成荧光收集效率降低，而对于与界面呈较大角度的荧光则会放生全反射现象，即荧光在基片与空气界面被全部反射回基片。而在油相中，由于油介质与基片基于相似的折射率，上述折射现象将不会发生，从而大大提高了透镜的收集效率。当然介质折射率的提高，数值孔径增大，成像的分辨率也随之提高。

图2.2.2 同一个透镜在不同介质材料中的收集效率，左侧是空气中，右侧是油相中。

色差与球差为了提高物镜的数值孔径，物镜的厚度一般比较后，因此已经不能当做薄透镜来处理，这种偏差也往往会影响显微系统的成像质量。常见的偏差有色差和球差：由于同一介质对不同波长的光的折射率，物镜对不同波长光的焦距不同，造成成像时不同波长的光不能同时聚焦在同一平面上而造成成像质量较差。另外一个比较重要偏差为球差，物镜对光轴上的处于焦点的物体成像较好，但是对于光轴外的物体，即使在焦点平面上，由于偏离光轴会造成的成像扭曲等现象，这大大影响显微镜的成像面积。为了消除这些偏差，现在的物镜一般都使用多个透镜（包括凸透镜和凹透镜）组合，以及不同折射率的材料进行组合从而使物镜的使用波长范围较宽，成像范围较大。

滤光片在单分子荧光显微镜中也起到非常重要的作用。实现单分子荧光检测除了荧光分子要有足够的荧光发射外，另一个重要条件是背景干扰要足够小。荧光探测中最主要的背景干扰来自激发光的发射、瑞利散射以及拉曼和杂质分子的荧光等，由于这些干扰光的波长不同，因此可以使用合适的滤光片将其滤除。滤光片是通过材料对不同波长的透过率不同实现对不同波长的光进行选择性透过。一般分为中性滤光片，长通滤光片、带通滤光片、短通滤光片和陷波滤光片等。顾名思义，长通、短通滤光片分别指比标示波长长或短的光可以通过，其他光则被发射或吸收；带通滤光片是指以标示波长，以标示带宽为宽度的波长范围的光可以通过，其他光被反射或吸收；中性滤光片是对所有波长的光进行同样程度的衰减，一般以对数尺度标示，如果标示为1，则将光衰减为原来的1/10。当然中性滤光片并非对所有波长的衰减程度完全相同，因此具体滤光片应对所使用波长进行测量。陷波滤光片是对特定波长的光进行截止而允许其他所有光通过的滤光片，一般用于滤除激发光。单分子荧光显微镜中检测需要选择特定滤光片，通常不止使用一种滤光片，而是多种滤光片组合使用。

玻片主要指二分之一波长玻片和四分之一波长玻片，在研究荧光偏振性质中使用。二分之一波长玻片可以改变线偏振光的偏振角度而四分之一波长玻片可以将线偏振光转变为圆偏振光。偏振片则选择性的通过特定偏振方向的光。通过组合使用偏振片可以检测荧光偏振方向和偏振程度等参数。

单分子荧光显微镜最常用的探测器主要有以下三种：光电倍增管，雪崩二极管和电荷耦合装置（CCD）。

光电倍增管光电倍增管是用于微弱光信号的光电转换器件。其基本原理是：在真空管中规则排列着一系列电极用于电子的放大，当光子首先照射到具有很高负电压（上千伏）的光阴极时，产生一个一级光电子，该光电子撞击到下一个电极时发生二次发射效应产生两个或多个二级电子，二级电子再次撞击下一个电极发射出更多的电子……，以此类推，一般一个光电倍增管可以将一个电子放大到百万个电子。因此光电倍增管具有非常高的灵敏度，并且其有效探测面积相对比较大，对某些研究来说非常方便。光电倍增管的另一个优势在于其暗噪音非常低，由于整个探测系统处于真空管中，一级光电子只能通过光激发才会产生，因此在没有光照的情况下，基本没有按噪音。但是光电倍增管由于其结构复杂，价格相对较高。而且倍增管会容易随着时间老化，放大效率下降。

雪崩二极管具有和光电倍增管相似的原理，只是其工作介质不是真空，而是固态材料。当在材料两端施加电压时，探测器表面产生的光电子会呈级数关系的被放大，到达材料另一端时，电子个数可以被放大到百万级别，很容易被检测。由于其结构简单，雪崩二极管一般相对比较便宜，同时其光探测的量子产率非常高，甚至可以达到90%。当然雪崩二极管缺点是有效面积较小，通常小于一百微米。对于共聚焦显微镜来说，由于所要探测的光斑很容易控制的比较小，因此有效面积一般不成问题。而且由于固态材料中不可避免的杂质，雪崩二极管总是会有一定的暗噪音，即使在没有光激发的情况下，材料中也会有一些电子被放大显示为背景噪音。因此商用雪崩二极管的价格与背景噪音的大小非常相关。

电荷耦合装置（CCD）CCD与以上两种探测器的最大区别是CCD是探测器阵列，由多个探测器组成。CCD最大的优势就是可以同时对多个目标（多个分子）进行同时探测，从而得到二维图像。CCD中每个像素（单独的探测器）具有对电子累计的功能，当所有像素完成累计后，统一进行数据读取。CCD的数据读取比较复杂，通常是一行一行的进行读取，这个过程相对较慢，大约毫秒量级，因此CCD最大的缺点是其采集速度较慢。目前一般CCD采集速度都在毫秒量级，因此对于有较快动力学过程的研究来说CCD并不适用。

单分子荧光光谱技术中的激发光源一般采用激光。激光具有较好的空间模式（高斯），光谱纯度以及足够的光强。激光器分为连接激光器和脉冲激光器，从发光介质来看又可分为气体激光器和固体激光器。

常用于单分子荧光光谱的的气体激光器主要有：

氦氖激光器氦氖激光器光谱纯度非常好，准直性也非常好，通常用于光路校准。其常用波长为633纳米，当然也有其它光谱线但是不常用。氦氖激光器价格便宜，功率大约几毫瓦，足够用于单分子荧光的激发，因此应用非常广泛。

氩离子激光器氩离子激光器是另一种使用非常广的激光器，在蓝绿光范围内具有多个谱线，较为常用的有514纳米，488 纳米和458纳米。氩离子激光器功率可以达到几瓦甚至十几瓦，因此不仅可以直接作为激发光源用于激发单分子染料，也可以作为泵浦光来泵浦其他激光器（如染料激光器）。

常用于单分子荧光光谱的的气体激光器主要有：

钛-蓝宝石激光器钛-蓝宝石激光器一般根据掺杂钛的蓝宝石晶体在泵浦光激发下进行荧光发射，通过调整激光共振腔选择特定的波长形成激光。钛蓝宝石激光器需要泵浦光源，比如上面所说的氩离子激光器。由于钛蓝宝石晶体荧光光谱较宽，因此其最大的特点是激光波长可调范围大，甚至可以达到几百纳米，这是其他激光介质无法比拟的。

Nd-YAG激光器Nd-YAG激光器利用另外一种激光介质Nd:Y3Al5O12晶体在泵浦光的激发下产生激光。Nd-YAG激光器发射波长为近红外光1024纳米，通过倍频晶体，合频晶体等可以得到532纳米或者355纳米的激光。Nd-YAG激光器通常用气体灯管（如氪气或氙气灯管）或激光二极管作为泵浦光源。

脉冲激光器脉冲激光器是通过锁相技术，对连续激光器的相位进行跳整和锁定，时激发光的输出功率只在很短的时间内完成，其余时间光强弱到不足以达到激光共振发射。对于钛-蓝宝石激光器来说，在其较宽的光谱范围前提下，锁相技术可以实现飞秒量级的激光脉冲。另外一种相对便宜的脉冲激光器为脉冲二极管激光器。商用脉冲二极管激光器脉冲相对较长，大约几个皮秒，但是对于一般染料的几个纳秒的荧光寿命来说已经足够，并且脉冲二极管激光器可选择波长非常广，因此在单分子荧光寿命测量特别是生物样品中单分子荧光实验中应用较广。